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(無題) 削除/引用 No.1115-11 - 2009/09/04 (金) 14:11:02 - う ＞私の場合、AcGFPにペプチド配列を組み込んだ遺伝子です。 どんなときも、します。 分子生物学的なことをやっている人にそこをさぼって安心できる人がいるとは思っていません。 ＞一過性発現とは具体的にどのような発現ですか？ トランスフェクションをした直後は、導入したDNAが大量に核に存在する細胞が多いです。 なので、発現量がかなり高いことが多いです。 しかし、詳しいことはわかりませんが、大量にあるDNAが細胞にとって悪影響を及ぼすのか、 時間が経つにつれてDNAが消失していったり？、大量に発現した細胞が死んだりして、 発現が弱くなる。 その弱くなる前が、一過性（過剰）発現。

(無題) 削除/引用 No.1115-10 - 2009/09/04 (金) 00:50:38 - ねうろん レトロウィルスタンパク質の代謝メカニズムを良く知らないのですが、エンドサイトーシスに乗ってライソソームに入ってそこだけ積極的に切られたとか。GFPってライソソームの中でも結構安定じゃなかったでしたっけ？蛍光自体は消失するけど、タンパクはそこにあると。だから過剰発現だし、顕微鏡下では残ったGFP-gagの蛍光がを拾えているけど、WBだとメインはGFPの長さのものになってしまうと。GFP-gagの有るべきサイズに何も出ていないのですかね？でているなら発現はしているでしょうし。あとお持ちならgagの抗体でWBしてみては。それとラボにライソソーム系の阻害剤が有れば。それと顕微鏡下でなんらかの違いは無かったのでしょうか？GFP細胞とGFP-gag細胞で。その辺がヒントになりそうな気が。 実際自分の場合もGFPのサイズにけっこうしっかりバンドみえたりしますしね。タンパク質によって程度の差はありますが。 勿論翻訳が途中で止まっている可能性もあるでしょうが、その場合はどういうアプローチがあるのでしょうかね。どなたか御存知でしたら教えて下さい。リンカー部分を変えるとか短くするとか長くするとかですかね、、、

(無題) 削除/引用 No.1115-9 - 2009/09/03 (木) 11:28:12 - とも 私が経験したのはGFPとあるタンパクを融合したときにメジャーバンドがGFPのみで、融合されているであろうバンドはほんの少ししか見えませんでした。 分解している、もしくはGFPで翻訳が止まっているという可能性はあと思います。 >また、細胞に投与する際の濃度はいくつですか？ トランスフェクションのことを言っているのなら、6wellで0.5μgも投与すれば十分だと思いますよ。私の場合はリポフェクトアミン2000を使っています。 濃度で言うと0.5μg当たり1.0mlのメディウムでトランスフェクションしています。 ＞あと、一過性発現とは具体的にどのような発現ですか？ トランスフェクションしてそのまま実験に使用する的なことです。 それとは別でステイブルだと、耐性遺伝子を持ったプラスミドをトランスフェクションして、薬剤とかでセレクションして、トランスフェクションできていない細胞を殺して、そこからクローンをとってきて、目的遺伝子がずーっと発現している細胞の事を言います。

(無題) 削除/引用 No.1115-8 - 2009/09/02 (水) 20:26:19 - GFP初心者 うさん 私の場合、AcGFPにペプチド配列を組み込んだ遺伝子です。 すいません、あと、一過性発現とは具体的にどのような発現ですか？

(無題) 削除/引用 No.1115-7 - 2009/09/01 (火) 11:15:40 - う ＞最終的なシークエンス解析は行っていますか？ 最終的にシーケンスを読まなくて実験するという賭けを好んでやるですか？ どんな結果になっても、すぐに思いつく不安な点を残したまま実験する気に、私はなれません。 ＞また、細胞に投与する際の濃度はいくつですか？ 何を投与するのでしょう？

(無題) 削除/引用 No.1115-6 - 2009/09/01 (火) 06:54:51 - おお >[Re:5] GFP初心者さんは書きました : > > 　最終的なシークエンス解析は行っていますか？ たいていの場合は配列を確かめます。 ペプチドということなので、合成したオリゴを挿入している ようなきがしますが、私の場合そういう場合は配列を読んでます。 > > 　また、細胞に投与する際の濃度はいくつですか？ これはトランスフェクションの方法、キットなどの プロトコールやマニアルを参照してください。

(無題) 削除/引用 No.1115-5 - 2009/08/31 (月) 20:31:10 - GFP初心者 　わたしもpAcGFpベクターを用いて実験しています。 　GFPのN末とC末に、目的のペプチド配列を導入しています。 　便乗して質問したいのですが、 　最終的なシークエンス解析は行っていますか？ 　また、細胞に投与する際の濃度はいくつですか？ 　検討違いな質問かもしれませんが、よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1115-4 - 2009/08/29 (土) 11:16:34 - おお インサートが削れて入ってインフレームになっている可能せい。。。

(無題) 削除/引用 No.1115-3 - 2009/08/29 (土) 08:24:53 - ~ GFPのC末に終止コドンがある可能性。 pAcGFP-gagと書かれていますので、GFPのC末にgagが入っているのでしょうか？ クロンテックのpAcGFP"1"の場合、3'MCSはGFPの終止コドンの下流にありますが、 pAcGFP1の3'MCSに入れたわけではありませんよね？ 別のベクターや位置であっても、フレームは確認できていますか？

(無題) 削除/引用 No.1115-2 - 2009/08/28 (金) 18:28:06 - う 単に、ウエスタンがうまくworkしていない可能性。

GFP融合ベクターにクローニングした 削除/引用 No.1115-1 - 2009/08/28 (金) 15:51:50 - shimashima pAcGFPベクター（Clontech社）のマルチクローニングサイトにレトロウイルスのgagをコードする遺伝子を組み込みました（以下pAcGFP-gagと略）。COS7細胞に一過性発現させたところ、蛍光顕微鏡で観察できましたが、抗GFP抗体でウエスタンブロットしたところ、pAcGFP-gagのバンドの位置が、ベクターをトランスフェクションしたサンプルと同じ位置にバンドが出てしまいました。これは、gagがタンパクに発現していなかったということでしょうか。 それともgagaはタンパク発現したものの、分解されてしまったのでしょうか。どのような可能性が考えられるでしょうか。pAcGFPベクターを用いた方でこのような経験された方おられますか？

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