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やはり 削除/引用 No.1113-10 - 2009/08/30 (日) 22:37:59 - 北の大地 そういうことなのですね。 うすうすそんな気はしていたのですが。。。 やはり転写因子そのものの発現量が少ないことが大きな要因と思われますので、 正常細胞か、株化細胞で強制発現させてChIPすることをボスに提案してみます。

(無題) 削除/引用 No.1113-9 - 2009/08/30 (日) 21:49:36 - natu ＞希釈して行くと立ち上がりが悪くなり35サイクル以降の検量線がうまく描けません。 これは単純に35サイクル以降が検出限界以下ということです。 多量のDNAをとれるよう、Chip時の条件検討をするべきではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1113-8 - 2009/08/28 (金) 21:18:13 - ザンギ 40サイクル以降の測定値で再現よく計測できてますか？ きちんと組まれた定量PCRならが通常増幅係数が2に近い数次になって、 そうすると計算上1コピーの鋳型分子でも通常35サイクルまでにはシグナル が出ます。 40サイクルという測定値は、鋳型の分子数が1分子以下に相当するので 理論上あり得ません。 装置の検出感度と測定系によって1コピーの鋳型を検出するサイクル数は 違うと思いますが、一般的には35サイクルが目安になってると思います。 それ以降に増えてくるのは、非特異的な増幅である危険が高くなると 思います。 対照試料でが35サイクル以降再現よく測れないっていうほうが正しいのかも？

その通りです。 削除/引用 No.1113-7 - 2009/08/28 (金) 20:59:05 - 北の大地 ご指摘の通り、むずかしいところです。 正常細胞を用いて、目的の転写因子を強制発現もさせず、nativeな状態で解析を試みてます。 標的の転写因子の発現量がさほどないため、うまく見る方法はないかと画策しながら、 とりあえず一般的な手法でChIPを試みているところです。 やはり株化細胞の強制発現系でやろうかとも思っております。 が、ボスの狙いもあり、とりあえず現状を打開したいのです。

http:// 削除/引用 No.1113-6 - 2009/08/28 (金) 19:45:57 - TK-1 そもそも４０サイクルでしか立ち上がらないPCRを使うことの方が問題があると思います。抗体が悪いか、プライマーが悪いのか知りませんが、そこで得られた結論に定量性があるとも思えませんし、そもそも本来得られるべきPCRプロダクトをみているのでしょうか。

思いつきですが、、、 削除/引用 No.1113-5 - 2009/08/28 (金) 11:53:04 - 北の大地 ChIPの最後にQIAGEN DNA purification kitで精製しておりますが、 このときの溶出に、Yeast tRNAやtakaraのeasy dilutionを使用すると、 サンプルのチューブへの吸着を防ぎ、シグナルが強くなることは 考えられますでしょうか？ 溶出効率が落ちるようでは困りますが、dilutionに使うくらいなので DNAを溶出させることに問題はないと思うのですがどうでしょう。

カキコミありがとうございます 削除/引用 No.1113-4 - 2009/08/28 (金) 10:34:10 - 北の大地 APさんの通り、過去に参考になるスレッドがあり、確認いたしました。 疲労困憊の深夜でしたので、検索を怠ってしまいました。すいません。 ひとまずTaKaRaのeasy dilutionとシリコナイズドチューブで行ってみます。 重ねての質問になりますが、ChIPのようにプロモーター上の配列を検出するのは 比較的難しいと聞いております。実際に、微量のDNAサンプルということもあり、 立ち上がりが遅いのが気になります。 こうした測定に適した試薬、おすすめの試薬がございましたら試してみたいと 思っておりますが、経験者の方々はどのような試薬を使用しておりますか？ 現在は、CYBR Green系のSTRATAGENE CAT#600548を使用しております。

(無題) 削除/引用 No.1113-3 - 2009/08/28 (金) 08:39:14 - 7878 Yeast tRNA以外の手法としては，takaraのeasy dilution希釈液が有効かと。どちらも低濃度の核酸がチューブに吸着するのを防ぐ目的で使われます。直接比較はしてませんが，水で希釈するより安定した感はあります。 http://catalog.takara-bio.co.jp/en/product/basic_info.asp?unitid=U100005918

(無題) 削除/引用 No.1113-2 - 2009/08/28 (金) 08:37:28 - AP チューブなどへの吸着によるロスが原因でしょう。大過剰のキャリアを加えることで、核酸総量に対する吸着ロスの割合を無視できるほど低くすることができます。関連する過去トピがいくつかあったと思います。 ttp://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;start=2;Code=294 リニアポリアクリルアミドを使っても同様の効果が望めるということが、上のトピに上げた文献にも触れられています。tRNAはそれほど高価な試薬だとは思いませんけれど、リニアポリアクリルアミドはエタ沈キャリアとして自作する方法が知られていますね（これも過去トピで紹介されていたはず）。

リアルタイムPCRにおけるスタンダードの希釈溶媒 削除/引用 No.1113-1 - 2009/08/28 (金) 01:56:15 - 北の大地 リアルタイムPCRのスタンダードを調整するときの溶媒について質問させていただきます。 現在、ChIPアッセイの検出にリアルタイムPCRを使用しております。 ChIP後のサンプルでは、40サイクル程度で増幅曲線が立ち上がります。 inputとの相対定量のために、inputをスタンダードとして希釈しました。 しかし、希釈して行くと立ち上がりが悪くなり35サイクル以降の検量線がうまく描けません。 発現量解析でのリアルタイムPCRのときは、プラスミドDNAをスタンダードに使用して、 水もしくはTEでスタンダードの希釈を行っており、今回も水で希釈しております。 実験マニュアル本には、yeast tRNAを加えて希釈すると検出限界を広げることができると 書いてありましたが、安くはないので購入を迷っております。 果たして大きく改善されるものでしょうか。 また、ChIP後の微量DNAサンプルを効率よく検出する方法はございますでしょうか。 詳しい方のご意見を参考にしたく思います。 よろしくお願いいたします。

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