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(無題) 削除/引用 No.1111-4 - 2009/08/28 (金) 11:52:28 - う 他の方がおっしゃる通り、 免疫染色自体の勉強をした方がいいかと。 PFA固定に比べて、�Bが流出を抑えると考える根拠もわからない。

(無題) 削除/引用 No.1111-3 - 2009/08/27 (木) 21:25:55 - 通りすがり 濃度振るにしても固定法変えるにしても賦活化するにしても、まずはその抗体が他の論文で使われているか探すことが先ではないでしょうか。 ＞シグナルが小さくうまくいきません。 たとえば初期胚や培養細胞だとステージが２４時間違うだけで発現が極端に変わる場合もあります。その点も注意が必要です。

(無題) 削除/引用 No.1111-2 - 2009/08/27 (木) 20:52:23 - み 低分子だの分泌されるだのと理由をおっしゃっていますが、 分泌蛋白なら分泌細胞の小胞体やゴルジ体の中で強く染まっても良いと思います。その辺はどうなのでしょうか？ 内分泌蛋白ですか？外分泌蛋白ですか？間質系細胞が分泌する蛋白ですか？ それによっても見るべきところも変わってくるだろうし、または、分泌された蛋白を理論的に染色で見るのは難しいと判断できるかもしれません。 いずれにせよ、分泌細胞の細胞内では染まってほしいですが。 抗体の質はどうなのか？データシートや論文に方法が記載されていないのか。などなど・・・・。

動物臓器組織 分泌タンパクの免疫染色 削除/引用 No.1111-1 - 2009/08/27 (木) 18:19:06 - nano 蛍光免疫染色の初心者です。 今、動物の組織中に分泌されるであろう低分子タンパクの局在を見ようとしているのですが、シグナルが小さくうまくいきません。膜タンパクはきれいに染まっています。 主なプロトコルは以下のとおりです。 ＜動物からのサンプル回収＞ ヘパリン入り生食還流→4％PFA還流→4％PFAに浸漬固定→スクロース溶液で脱水→OCTで凍結包埋、切片作製 ＜染色＞ PBS wash→Blocking, 1h at 37℃ (BSA or serum in 0.3%TritonX )→1st Ab, over night at 4℃ →PBS wash, 2nd Ab→封入→撮影　 今のところ考えている原因と対策は �@抗体の濃度が適切でない　→濃度をふって検討してみる？ �Aヘパリン結合性タンパクとの情報もあるので、還流中に流出した　→生食に変更？ �B低分子分泌タンパク質のため、染色作業中にBufferに流れ出てしまった　→ 染色を行う前に、冷メタノールやアセトンで固定してみて流出を抑える？ です。免疫染色にお詳しい方、分泌タンパクを染めたことがある方、対策やアドバイス等ありましたらよろしくお願いします。 （なお�Bの対策は、プロトコル集・文献に載っていて応用できるかもしれないと考えたものです。ただ、冷メタノールやアセトンで固定するのは新鮮凍結切片やPFA固定ができないサンプルだとも書いていましたので、適切ではないかもしれません。）

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