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Re: 削除/引用 No.111-5 - 2009/03/01 (日) 01:03:44 - UC こんにちは。頻度から言えば、プライマーダイマーかなと思います。系にもよりますが、融解曲線でも分かりますし、PCR産物をゲルに流せば一発で分かります。

ectopic expression 削除/引用 No.111-4 - 2009/02/28 (土) 09:39:31 - かわ ゲノムのコンタミについては先にかかれている通りです。 ＞ターゲット遺伝子が発現していないはずのサンプルでも増幅が見られました。 とありますが、発現していないと思われるサンプル（組織）でもわずかの発現をみることはあります。（ectopic expressionと呼びます） コントロールとしてはやはり古典的ですが、酵素を入れないRTマイナスサンプルがよろしいかと思います。イントロンを挟むのは有効で私も必ずそうしますが、expressed processed psuedogeneの場合はイントロン挟んでも出てきますので、完璧ではないですね。

(無題) 削除/引用 No.111-3 - 2009/02/28 (土) 09:37:23 - う natuさん、ご回答ありがとうございます。 ところでTotal RNA抽出ですが、 QIAGENのRNeasyを用い、DNaseI処理行っています。 それでもDNAが残ってしまい、 それがReal-time PCRに影響する可能性は考えられるでしょうか？ いづれにしても、 この可能性を検証するにはご指摘の通り 「逆転写前のRNAをテンプレートにPCRしてみる」 のが一番ですね。

(無題) 削除/引用 No.111-2 - 2009/02/28 (土) 01:45:52 - natu RNA抽出法によってはゲノムDNAが完全に除去できないケースがあります。 1)逆転写前のRNAをテンプレートにPCRしてみる 2)イントロンをはさんでプライマーを組む 1)で増幅が見られればゲノムDNAのコンタミ 2)で増幅が見られればターゲットが実は微弱に発現している ことになるとおもいます。 ゲノムのコンタミであればRNA抽出法を変えるか DNase処理をするという手があります。 QIAGENのキットで途中でDNase処理をする方法があったはずです。

Real-time PCRでネガコンサンプルで増幅が見られる 削除/引用 No.111-1 - 2009/02/28 (土) 01:38:05 - う Total RNA抽出、RT反応後のcDNAサンプルをテンプレートとして、 Real-time PCRを行いました。 ターゲット遺伝子が発現していないはずのサンプルでも増幅が見られました。 Total RNA抽出時のDNAのコンタミの可能性を考えていますが、 この原因として何が考えられるか、 ご教授よろしくお願い申し上げます。

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