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(無題) 削除/引用 No.1109-14 - 2009/10/14 (水) 08:55:05 - CJ あーすみません。へんな書き方をしてしまいました。 「ＭＯＭがノンスペの原因と考える理由は何でしょうか？」 でした。 核にノンスペが出る、っていうのはとても良くある免疫染色の失敗なので、その原因をキットに求めるのは容易ではない気がするので書きました。 ステップが増えるとそれだけで失敗しやすくなるので、ＭＯＭのステップを省く、という実験が厳密にコントロールにならない気がします。（大福さんの経験がどれほどかわかりませんので、失礼な書き方になっているかもしれません。ご容赦ください。）

(無題) 削除/引用 No.1109-13 - 2009/10/13 (火) 15:33:49 - 大福 > 私は神経組織でＭＯＭを使いましたが、経験の限りではＭＯＭが原因でノンスペが出たことはありません。ＭＯＭがノンスペとお考えになる根拠は何でしょう？ 膜のみに局在するタンパクを認識する抗体。 これを使用して核が染まった。　　という点です。 Vectorもこれを認めました。 神経組織では問題なかったとのこと。 筋組織の凍結切片、これに特異的な現象なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1109-12 - 2009/10/13 (火) 12:16:38 - CJ 私は神経組織でＭＯＭを使いましたが、経験の限りではＭＯＭが原因でノンスペが出たことはありません。ＭＯＭがノンスペとお考えになる根拠は何でしょう？

(無題) 削除/引用 No.1109-11 - 2009/10/10 (土) 12:00:06 - 大福 > 与えられた情報の限りでは、核が染まるのはいかにもノンスペっぽいですね。 レスありがとうございます。 ご指摘のとおり、当方、ノンスペと考えています。 このkitは、とくに核をみるときには、使えないような気がします。（もちろん、膜タンパクをみるときも） 筋組織以外ではこのようなことは起きていないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1109-10 - 2009/10/09 (金) 19:24:49 - CJ 与えられた情報の限りでは、核が染まるのはいかにもノンスペっぽいですね。

Vector社のM.O.M. blockinｇ剤 削除/引用 No.1109-9 - 2009/10/09 (金) 11:07:36 - 大福 乗っかってすみません。 膜タンパクの発現をみる目的で、表記を使用してマウス筋組織凍結切片を免疫染色したところ、あろうことか、核が染まってしまいました。 一次抗体は膜タンパクに対するマウスモノクローナル抗体です。 なぜ、核が.....？ 同様のご経験をされた方はおられますでしょうか？

Vector社のM.O.M. blockinｇ剤の組成 削除/引用 No.1109-8 - 2009/08/27 (木) 17:50:29 - だるま BlueHornetさん 書き込みありがとございます。 さっそく、DAKOに『免疫組織・細胞染色ガイド』を資料請求しました。 『ポリマーイムノコンプレックス法』の参考文献もざっと目を通してみました。免疫染色だけでなく、WBでも使っているのですね。この方法ならば、IP-WBの時に出るH鎖やL鎖のバンドを検出させなくするといった応用も可能そうですね。勉強になりました。ありがとうございます。 Eireさん 勉強になりました。確かに、ブロッキング用途に抗ラットIgG(または抗マウスIgG)を使うのであれば、Fabでなければブロッキング効果は十分に発揮されないことになりますね。確かに、JacksonのHPを見返してみたら、「Monovalent Fab Fragments of Affinity-Purified Antibodies for blocking and for double labeling」という用途の抗体群が用意されていますね。 本当にありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1109-7 - 2009/08/27 (木) 16:32:31 - Eire > ブロッキングに使う抗ラットIgGは、Whole IgでもFabでも原理的にはどちらでもよいと考えていました。後学のために、Fabの方がよい理由や経験談などをお教えください。 Whole Ig (Fab2 もそうですね）だと抗体分子１分子中に抗原結合部位が２カ所あり、そのうち１カ所のみが抗原と結合し、他方は何にも結合せずに「余っている」状態であることがほとんどであるらしいです。ブロッキング操作後、その「余った」結合箇所に一次抗体が結合してしまう可能性があり、バックグラウンドがあがる可能性がある、ということだったと思います（すみません、伝聞調で）。 Fab だと抗原結合部位は一カ所だけで、マウス Ig に結合した抗体分子についてはすべての抗原結合部位が飽和しているので、「余った」結合部位によって一次抗体をトラップしてしまうことがないですよね。 私も mouse on mouse でしか試したことがなく、また whole Ig との比較はしたこともありませんが、確かに （抗マウス IgG）Fab fragment による内在性マウス Ig のブロッキングは有効でした。 では、お役に立てば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1109-6 - 2009/08/27 (木) 12:49:20 - BlueHornet DAKOの『免疫組織・細胞染色ガイド』に『ポリマーイムノコンプレックス法』としてプロトコールが載っていますよ。 参考文献として 1. Fukuda T, Tani Y, Kobayashi T, Hirayama Y, Hino O. A new Western blotting method using polymer immunocomplexes: detection of Tsc1 and Tsc2 expression in various cultured cell lines. Anal Biochem. 2000;285:274-276 2. Koizumi K, Tsutsumi Y, Kamada H, Yoshioka Y, Watanabe M, Yamamoto Y, Okamoto T, Mukai Y, Nakagawa S, Tani Y, Mayumi T. Incorporation of adult organ-derived endothelial cells into tumor blood vessel. Biochem Biophys Res Commun. 2003;306:219-224 と記載があります。

Vector社のM.O.M. blockinｇ剤の組成 削除/引用 No.1109-5 - 2009/08/27 (木) 11:59:56 - だるま 検索をしていたら、２ちゃんねるで以下のような書き込みをみつけました。 (他の掲示板のことで申し訳ありませんが、ここで少し議論させてください。) ＞Vector StainにMOM kitもいいけど、単純に、一次抗体(マウス）と、 ＞二次抗体〈抗マウス）をまず混ぜて一時間ほど置き、コンプレックスを作り、 ＞それから余分な二次抗体を除くのに、その正常血清(マウス）を、 ＞混ぜてから、30分ほどおいてから、普通の一次抗体のように反応させると、 ＞きれいです。 http://cheese.2ch.net/life/kako/1011/10116/1011633196.html 上記の方法はDAKOジャパンのHPに書いてあると、書き込みをした人はおっしゃっています。 この染色方法の原著論文をご存知の方はいらっしゃいませんか？ よろしくお願いします。

Vector社のM.O.M. blockinｇ剤の組成 削除/引用 No.1109-4 - 2009/08/27 (木) 11:29:35 - だるま 引き続き、 M.O.M. blocking regentの組成をご存知の方、 使った経験のある方、抗ラットIgG(または抗マウスIgG)でのブロッキングと比較されたことのある方は、アドバイス等をよろしくお願いします。

Vector社のM.O.M. blockinｇ剤の組成 削除/引用 No.1109-3 - 2009/08/27 (木) 11:24:58 - だるま Eireさん投稿ありがとうございます。 ＞二次抗体の抗ラット IgG がマウス組織に残っている IgG に非特異的に ＞結合することによるバックグラウンドが生じることを避けたいのですよね？ はい、そうです。 ＞ホールマウントでの経験はありませんが、マウス脳のビブラトーム切片 ＞（５０マイクロメーター）では、 Rat anti- myelin basic protein -> ＞Donkey anti-Rat IgG (H+L)-Cy2 (minimum X; Jackson ImmunoResearch) ＞という免疫染色をしたときは、バックは出ずきれいな像が得られました。 確かに、以前、一次抗体：Anti-CD31 mouse monoclonal→二次抗体：Donkey anti-mouse IgG (H+L)-Cy3 (minimum X; Jackson ImmunoResearch)でキレイに免疫染色ができました。たぶん、Jacksonの抗体を使えば、解決できると思います。Donkey anti-Rat IgG (H+L)-Cy2 (minimum X; Jackson ImmunoResearch)の納期を問い合わせてみます。 ところで、 ＞また抗ラット IgG によるブロッキングを行うときには whole Ig ではなく ＞ Fab fragment を使うのがより良いと思います。 ブロッキングに使う抗ラットIgGは、Whole IgでもFabでも原理的にはどちらでもよいと考えていました。後学のために、Fabの方がよい理由や経験談などをお教えください。

(無題) 削除/引用 No.1109-2 - 2009/08/27 (木) 05:30:26 - Eire ご質問に対する直接の回答ではないので躊躇したのですが、参考になるかもと思い投稿させていただきました。 二次抗体の抗ラット IgG がマウス組織に残っている IgG に非特異的に結合することによるバックグラウンドが生じることを避けたいのですよね？ この場合、二次抗体にマウス IgG との交差反応が極力起きないように、あらかじめマウス IgG で吸着処理された抗ラット IgG 抗体を使えば、事前のブロッキングに特別な処理は必要ないような気がするのですがいかがでしょうか？ 僕が知るところでは Jackson ImmunoResearch からそのような二次抗体 (HP では min X と表記されています; Whole Ig, Fab2 fragment, Fab fragment あり。各種標識済み抗体あり。免疫動物にはロバ、ヤギ、マウスが用意されています）が販売されています。 ホールマウントでの経験はありませんが、マウス脳のビブラトーム切片（５０マイクロメーター）では、 Rat anti- myelin basic protein -> Donkey anti-Rat IgG (H+L)-Cy2 (minimum X; Jackson ImmunoResearch) という免疫染色をしたときは、バックは出ずきれいな像が得られました。 ちなみに M.O.M については以前調べたことがありましたが、組成については分かりませんでした。また抗ラット IgG によるブロッキングを行うときには whole Ig ではなく Fab fragment を使うのがより良いと思います。

Vector社のM.O.M. blockinｇ剤の組成 削除/引用 No.1109-1 - 2009/08/26 (水) 18:36:25 - だるま 現在、マウスの組織(ホールマウント)をラットのモノクロで染色しようとしています。この際のブロッキングにVector社のM.O.M. blocking regentを使うか、それとも非標識の抗ラットIgGを使うかで悩んでいます。 M.O.M. blocking regentは、非標識の抗ラットIgGと同等のものなのでしょうか。組成をご存知の方はいらっしゃいませんか。 また、M.O.M. blocking regentは、非標識の抗ラットIgGよりも優れたS/N比を示すのでしょうか。 よろしくお願い致します。

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