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ありがとうございます。 削除/引用 No.110-15 - 2009/03/11 (水) 11:37:04 - かわ すいません。しばらく別の実験をしていたため目を通しておりませんでした。 EcoRI様、建前様、ありがとうございます。 ＞膜貫通の直上にストップコドンを入れるといっても、ドコにいれるかは悩みどころかもしれません。膜貫通ドメインを予測するウェブサイトでいくつか試してみる必要があるかもしれません。 これは多分それほど問題にならないかもしれません。予測としてはhydropathy plotとSosuiとHMM-TMを使いましたが、１−２アミノ酸残基ほどの違いはありますがどれも同じような結果でした。ですのでおおよその予測は立てられます。 ＞これはちょっと慎重になる必要があるかと思います。 熱とSDSで変性させると、タンパク質が凝集して(特に膜タンパクはその傾向が強いそうです)PAGelに入って行かないことがあるそうです。 これ昔、大海忍先生の記述で読んだことがあります。確かにその可能性も少し考えないとダメですねえ。 ＞外来のシグナル配列、膜貫通配列を大腸菌は大変嫌うことが多いです。私なら、最初から、GST-シグナルなし＞膜貫通配列前まで、GST-膜貫通配列後部分だけにします。 具体的なご助言助かります。これまでの皆様のご意見を統合すると、どうもこのような感じが最も良いということになろうかと思います。この線でコンストラクト作成を行うこととします。 ＞糖鎖の修飾が必要だった場合、相互作用はみられません。 これものすごく重要ですよねえ。そうしますと、もしネガの大腸菌で作成して結果だった場合、昆虫細胞でbeit、preyの両方あるいはどちらかを作成しないとだめということになるのでしょうか？あるいはin vitro translationでどちらも作ってしまうとか？直感的にはbeitタンパクはそこそこ収量がいりそうなので大腸菌かなあなんて考えていましたが・・・。

(無題) 削除/引用 No.110-14 - 2009/03/03 (火) 10:41:00 - 建前 外来のシグナル配列、膜貫通配列を大腸菌は大変嫌うことが多いです。 私なら、最初から、GST-シグナルなし＞膜貫通配列前まで、GST-膜貫通配列後部分だけにします。 糖鎖の修飾が必要だった場合、相互作用はみられません。

(無題) 削除/引用 No.110-13 - 2009/03/02 (月) 20:45:44 - EcoRI >す、すみません！ 「2nd Met から」ではなく「2nd アミノ酸から」と書きたかったのです。 >大変失礼しました。 了解です。 それで筋が通ります。 膜貫通の直上にストップコドンを入れるといっても、ドコにいれるかは悩みどころかもしれません。 膜貫通ドメインを予測するウェブサイトでいくつか試してみる必要があるかもしれません。 >封入体どころか発現さえしませんでした。（菌体ペレットをそのままサンプルバッファーで溶かしてウエスタンして確認しました。） これはちょっと慎重になる必要があるかと思います。 熱とSDSで変性させると、タンパク質が凝集して(特に膜タンパクはその傾向が強いそうです) PAGelに入って行かないことがあるそうです。

ありがとうございます。 削除/引用 No.110-12 - 2009/03/02 (月) 20:37:16 - かわ ｸﾞﾚｰﾄｽｰﾊﾟｰﾃｨｰﾁｬｰ（ＧＳＴ）様、EcoRI様。お忙しいところ、初心者の私の質問に回答して頂き、本当に感謝しております。お二人のご意見を総合して、おおむね検討すべき課題が見えてまいりました。EcoRI様のおっしゃるようにいくつかコンストラクトを試すのが正解のようですね。がんばってみます。とりあえず解決なのですが、もしかしたらまた有意義なコメントを下さる方もおられるかも知れませんし、検討後にまた質問したいので、しばらくこのまま置いておきたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.110-11 - 2009/03/02 (月) 20:03:02 - ｸﾞﾚｰﾄｽｰﾊﾟｰﾃｨｰﾁｬｰ（ＧＳＴ） す、すみません！ 「2nd Met から」ではなく「2nd アミノ酸から」と書きたかったのです。 大変失礼しました。 1st Met を外すのは、誤ってそこから翻訳開始してしまうのを防ぐためです。 気休め程度ですが（Shine-Dalgarno配列参照）。

(無題) 削除/引用 No.110-9 - 2009/03/02 (月) 16:40:43 - EcoRI >今のところ結合に関与している領域が膜貫通ドメインのN側かC側かわからないので、とりあえずwholeで発現させようかなあと思っていました。 ははぁ、事情が飲み込めました。 その膜貫通の部分がネックになって不溶性に発現するかもしれませんね >膜貫通ドメイン前に人為的にストップ入れたほうが良いかも？ですね。 そうですね。 あれこれ考えずに、いくつかコンストラクトを作ってみる、というのが 遠回りに見えて、近道かもしれません。 シグナルありなし、膜貫通ありなし で４つですか。なんとかなる数字ですね。

ハンドルネーム 削除/引用 No.110-8 - 2009/03/02 (月) 16:17:16 - かわ すいません。最初に質問したときに同じラボの別の人間のパソコンから入力したため、ハンドルネームがおかしなことになっております。ややこしくてすいませんでした。

なるほど！です。 削除/引用 No.110-7 - 2009/03/02 (月) 16:14:42 - かわ EcoRI 様。 ＞シグナル配列をコンストラクトに入れると、そこは疎水性が高い部分なので、 GST fusionだろうと、封入体に行ってしまうリスクが高まります。 その意味も含めて、シグナル配列っぽい部分<MARGPGLAPPPLRLPLLLLVLAAVTGHTAA>は排除して、 コンストラクトを作るのがいいのでは、と考えました。 なるほど！です。 おっしゃるようにこのタンパクは膜タンパクですので疎水性の高い領域を含みます。おっしゃるようにN末のシグナル配列やＣ末近くの膜貫通ドメインを省くと親水性が高まり封入体に入る可能性は減りますね。シグナルペプチドは確かにいらないと思うのですが、今のところ結合に関与している領域が膜貫通ドメインのN側かC側かわからないので、とりあえずwholeで発現させようかなあと思っていました。ちなみにＧＳＴタグをつけずに大腸菌で発現させようと試みましたが、温度を変えたりしても封入体どころか発現さえしませんでした。（菌体ペレットをそのままサンプルバッファーで溶かしてウエスタンして確認しました。）膜貫通ドメイン前に人為的にストップ入れたほうが良いかも？ですね。 >そのあたりについてもご意見いただけますでしょうか？ >GSTさんが仰る1st Met, 2nd Metというのがイマイチ把握できないので、GSTさん待ちですが… 2nd Metまで削る理由がよくわかりません。 シグナル配列を入れるコンストラクト、入れないコンストラクトの２種類を作る ってことで、いいと思うのですが… とりあえずどちらも作った方が良いみたいですね・・・。 非常に参考になりました。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.110-6 - 2009/03/02 (月) 14:21:54 - EcoRI あぁ、読み違えてました。 GSTのC末側、ですね。申し訳ないです。 シグナル配列をコンストラクトに入れると、そこは疎水性が高い部分なので、 GST fusionだろうと、封入体に行ってしまうリスクが高まります。 その意味も含めて、シグナル配列っぽい部分<MARGPGLAPPPLRLPLLLLVLAAVTGHTAA>は排除して、 コンストラクトを作るのがいいのでは、と考えました。 あと、配列を拝見すると、目的タンパク質のC末端あたりに疎水性アミノ酸が並んでいるのが、気になります。 >そのあたりについてもご意見いただけますでしょうか？ GSTさんが仰る1st Met, 2nd Metというのがイマイチ把握できないので、GSTさん待ちですが… 2nd Metまで削る理由がよくわかりません。 シグナル配列を入れるコンストラクト、入れないコンストラクトの２種類を作る ってことで、いいと思うのですが…

ありがとうございます。 削除/引用 No.110-5 - 2009/03/02 (月) 13:59:24 - かわ EcoRI様。 >あまり配列そのものを記載することは避けた方がいい、と思います… 今はすぐに調べることができますし。 おっしゃるとおりでございます。入力しながらちょっと気になったのですが、まあ遺伝子がわかっても大丈夫かなあなんて思いまして。でも確かに軽率ですね。今後控えようと思います。 ＞<Vector_Met>-<Mature Protein>-<linker>-<GST>-<Vector_stop> という構造にするといいと思います。 今考えているベクター（GEヘルスケアのもの。定番だそうですので・・・）ではGSTは目的タンパクのN側に付加されます。またベクターは大腸菌発現ようです。ですので、シグナル配列については考慮しなくてよいのでは？と考えております。 今考えているのは目的タンパクをGSTタグつきで大腸菌で発現させ、これをbaitとして、プルダウンアッセイをしようかなあと思っております。preyタンパクはin vitro translationでRI標識して、最終的にプルダウン後にPAGEで流してオートラを考えております。 それでベクターとインサートのシーケンスなのですが、 <Vector_Met>-<GST>-<linker>-<Mature Protein with an abrogated natural stop codon>-<linker><Vector_stop> でよいでしょうか？ またその場合、Mature Proteinの開始コドンを省くべきか、そのままでも良いのか、あるいはGST様のいうように思い切って２番目のMetまで省くべきなのか、そのあたりについてもご意見いただけますでしょうか？ すいませんいろいろ質問しまして・・・。どうかよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.110-4 - 2009/03/02 (月) 13:28:05 - EcoRI あまり配列そのものを記載することは避けた方がいい、と思います… 今はすぐに調べることができますし。 もしシグナル配列がどこまでかがわかっているなら、 <Vector_Met>-<Mature Protein>-<linker>-<GST>-<Vector_stop> という構造にするといいと思います。 このとき、成熟タンパク質のストップは外すように、プライマーを設計すれば、いいはずです。 で、発現・精製後にプロテアーゼでタグを切り離してやれば、 機能的なタンパク質に近い組換え体ができるのではないか、と思います。 もし、目的のタンパク質由来のストップを入れると、GSTがついてきません。

ありがとうございます。 削除/引用 No.110-3 - 2009/03/02 (月) 10:57:40 - かわ ｸﾞﾚｰﾄｽｰﾊﾟｰﾃｨｰﾁｬｰ（ＧＳＴ）様。コメントありがとうございます。すこし質問させていただいてよいでしょうか？ ＞2nd Met からにした方が無難かもしれないです。 とのことですが、1st Metから2nd Metまでのアミノ酸をすべて省くとなるとすこし問題が生じる可能性があるように思うのですが・・・。 目的のタンパクの配列は MARGPGLAPPPLRLPLLLLVLAAVTGHTAAQDNCTCPTNKMTVCSPDGPG GRCQCRALGSGMAVDCSTLTSKCLLLKARMSAPKNARTLVRPSEHALVDN DGLYDPDCDPEGRFKARQCNQTSVCWCVNSVGVRRTDKGDLSLRCDELVR THHILIDLRHRPTAGAFNHSDLDAELRRLFRERYRLHPKFVAAVHYEQPT IQIELRQNTSQKAAGDVDIGDAAYYFERDIKGESLFQGRGGLDLRVRGEP LQVERTLIYYLDEIPPKFSMKRLTAGLIAVIVVVVVALVAGMAVLVITNR RKSGKYKKVEIKELGELRKEPSL ですので、1st Metから2nd Metまでの間に MARGPGLAPPPLRLPLLLLVLAAVTGHTAAQDNCTCPTNK のアミノ酸があります。いかがでしょうか？ またそもそも、1st Metは外さなくてはならないのでしょうか？それとも外さなくても問題はないのでしょうか？ すいません。よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.110-2 - 2009/02/28 (土) 10:53:17 - ｸﾞﾚｰﾄｽｰﾊﾟｰﾃｨｰﾁｬｰ（ＧＳＴ） 通常、制限酵素サイト付加による余分なアミノ酸は仕方ないものとして無視します。 むしろＧＳＴと融合するタンパク質の間にある程度のリンカーがあった方が良いくらいです。 本来のストップは使ったほうが良いですが、本来の 1st Met は外し、2nd Met からにした方が無難かもしれないです。 ただ、上記に関しては念頭においておき、何か予期せぬ結果が出たときは可能性の１つとして検討すべきです。

GST融合タンパクの作成について 削除/引用 No.110-1 - 2009/02/27 (金) 20:28:34 - やまさき いつも勉強させてもらっています。過去トピをGSTで検索をかけましたが、自分の疑問に対する答えは得られませんでしたので、質問させていただきたく存じます。どうかよろしくお願いします。 今度GSTプルダウンの実験を行うことになりました。これまでGSTプルダウンの実験を行ったことはなく、いろいろ調べながらやるような感じです。 ものすごく単純な質問なのですが、目的の遺伝子のコーディング配列をGST発現ベクターに組み込む時、買おうとするベクターの場合はGSTのC末側に入れるのですが、MCSあたりに余分なアミノ酸が少々入ります。また目的の遺伝子はPCRで増幅するのですが、制限酵素サイトを目的遺伝子の5'末に加えますので、そこでも余分なアミノ酸を少々加えることになります。このとき、このアミノ酸だけは入れないようにすべきというアミノ酸なんてあるのでしょうか？ また目的の遺伝子の開始コドンのATGは除いた方が良いのでしょうか？またベクターそのものにストップコドンが入っており、GST単独でも発現できるようになっており、陰性コントロールとしてはこれを使用しようと考えておりますが、目的の遺伝子を入れる場合でも、ベクターにもともとついているストップコドンを使うのか、あるいは目的遺伝子のnaturalなストップコドンを使うのかどちらなのでしょうか？ 文章が長くなり読みにくくなりましたが、ご存知の方はどうかご教授のほどよろしくお願いします。

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