全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1092-6 - 2009/08/26 (水) 09:49:53 - たかお 皆様ご親切にありがとうございます。 ＞増殖はするが、形が丸くなっているのであれば、経験的ですがRANKLによる破骨細胞への分化がしにくいという印象を持っています。 →まさにそのような感じで、ノーマルの細胞に比べて確かに形が丸く、接着しにくいような感じです。 ＞リポフェクトアミンも膜に作用するので何かあるかもしれませ（ん）ね。 →リポフェクトアミンを処理すると膜への障害をも起こしてしまうのですか（一過性に膜に作用するのではないのですかね？）いずれにしてもリポフェクトアミンも十分に考えられますのでプロトコールどうり処理して検討してみます。 ＞I could troubleshoot by using fresh alpha-MEM, instead old alpha-MEM. →同時に同じプレートでノーマルの細胞と一緒に分化させますが、こちらは普通にできます。導入した細胞だけできません。フレッシュメディウムにしても同じです。 ＞安定発現株を作製する際に継代数がいってしまったのでは？ →可能性はあります。私ごとですが、現在のラボに移ったばかりなので細胞株作成にはタッチしてません。なのでどのくらいの継代数いったものを使用したのか不明です。 きちんと破骨に分化できる細胞株で再作成した方がいいかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.1092-5 - 2009/08/25 (火) 16:07:26 - genji 細胞の形態はどうなっているでしょうか？ 増殖はするが、形が丸くなっているのであれば、経験的ですがRANKLによる破骨細胞への分化がしにくいという印象を持っています。(RAW264の場合） たとえばRANKLの系で1% DMSO(final)を添加するとまったく破骨細胞に分化しなくなりますが、これはDMSOが細胞膜等に障害を与えているからだと推測されています。メタノールやエタノールは問題ありません。リポフェクトアミンも膜に作用するので何かあるかもしれませね。 Hiroさんがご指摘のように活性化ビタミンD3を使う方法がありますが、こちらにトライしてみてもよいかもしれません。 suggestionになっていませんが。。。

media (re-transmit) 削除/引用 No.1092-4 - 2009/08/25 (火) 01:54:12 - Hiro Sorry for garbled characters. I had a trouble about osteoclastogenesis from RAW 264.7 cells for several months ago. The trouble was no TRAP positive multinucleated cells formation even in "certain" positive control. At that case, I could troubleshoot by using fresh alpha-MEM, instead old alpha-MEM. After that, I found the following paper. Osteoclast Differentiation Requires Ascorbic Acid、J Bone Miner Res 1998;13:970-977 Now I presumed ascorbic acid in old media was depleted and that was the reason of failure. Such sbsurd problem can not happen in the lab. constantly consumes huge amount of media. As regards other posi. control, conventional bone marrow culture with 1,25-(OH)2D3 is well-known method. But I'm not sure if the system suit for Dr. Takao's experiments or not...

media 削除/引用 No.1092-3 - 2009/08/25 (火) 01:31:35 - ､ﾒ､� ･皈ﾇ･｣･ｦ･爍｢ﾐﾂ�r､ﾊ､筅ﾎ､�､ｪﾊｹ､､､ﾇ､ｷ､遉ｦ､ｫ? ､ｷ､ﾐ､鬢ｯﾇｰ､ﾋ｡｢､､､ｯ､魘_携､ﾊ･ﾝ･ｸ･ｳ･�､�ﾔOｶｨ､ｷ､ﾆ､禝RAP齧ﾐﾔｶ犲ﾋｼ垈�､ｬRAW264.7､ｫ､鰔ﾎｳﾉ､ｵ､�､ｺﾀｧ､ﾃ､ｿ､ｳ､ﾈ､ｬ､｢､熙ﾞ､ｷ､ｿ｡｣ ､ｽ､ﾎ､ﾈ､ｭ､ﾏﾙ省�､ｷ､ｿ､ﾆ､ﾎalpha-MEM､�ﾊｹ､ｦ､ｳ､ﾈ､ﾇ･ﾈ･鬣ﾖ･�･ｷ･蟀`･ﾈ､ﾇ､ｭ､ﾞ､ｷ､ｿ｡｣ Osteoclast Differentiation Requires Ascorbic Acid｡｢J Bone Miner Res 1998;13:970ｨC977 ､ﾈ､､､ｦ･ﾚｩ`･ﾑｩ`､筅｢､熙ﾞ､ｹ､ﾎ､ﾇ｡｢･皈ﾇ･｣･ｦ･獰ﾐ､ﾎAscorbic Acid､ｬﾁﾓｻｯ､ｷ､ﾆ｣ｨ｣ｿ｣ｩ･ﾈ･鬣ﾖ､ﾃ､ﾆ､､､ｿ､ﾎ､ﾇ､ﾏ､ﾈｿｼ､ｨ､ﾆ､､､ﾞ､ｹ｡｣ ｼ垈�､�ｴ�ﾁｿ､ﾋﾅ瑩B､ｷ｡｢･ｳ･�･ｹ･ｿ･�･ﾈ､ﾋ･皈ﾇ･｣･ｦ･爨�ﾏ�ﾙM､ｹ､�･鬣ﾜ､ﾇ､ﾏ､｢､熙ｨ､ﾊ､､･ﾈ･鬣ﾖ･�､ﾇ､ｹ､ｬ... sRANKL｣ｨ+M-CSF｣ｩ､�ﾊｹ､ﾃ､ｿ･ﾝ･ｸ･ｳ･�ﾒﾔﾍ筅ﾋ､ﾏ｡｢ﾎ�､ﾊ､ｬ､鬢ﾎbone marrow cell ､�ｻ�ﾐﾔﾐﾍ･ﾓ･ｿ･ﾟ･�D3､ﾇｴﾌｼ､､ﾈ､､､ｦｷｽｷｨ､筅｢､熙ﾞ､ｹ｡｣ ､ｿ､ｫ､ｪ､ｵ､�､ﾎ携�Yﾏｵ､ﾋ､ﾕ､ｵ､�､ｷ､､､ｫ､ﾉ､ｦ､ｫ､ﾏ､�､ｫ､熙ﾞ､ｻ､�､ｬ｡｣

継代数 削除/引用 No.1092-2 - 2009/08/24 (月) 19:53:59 - hone ATCCから購入後の継代数が18から20を超えたものは破骨細胞に分化しない． と，Methods in Molecular Medicine, vol.80, Bone Research Protocolsに書かれています． 安定発現株を作製する際に継代数がいってしまったのでは？

RAW264.7 破骨細胞 削除/引用 No.1092-1 - 2009/08/24 (月) 10:42:35 - たかお 初めて質問させていただきます。RAW264.7細胞をRANKL刺激し破骨細胞を見ています。あるタンパクのドミネガ安定発現株を作成すすためにpcDNA3.1にドミネガのcDNAを組み込んでリポフェクタミンでトランスフェクションしました。しかし、コントロールとして空ベクターだけトランスフェクトした細胞がRANKL刺激で野生型細胞と同じように破骨細胞へ誘導されるか確認したのですが、全然破骨細胞ができません。 もし上記方法で試されたことのある方、またほかのお勧めの方法をご存知の方がいらっしゃいましたら、ご教示お願いいたします。

全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---