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リボソームサブユニットの調整法 削除/引用 No.1089-3 - 2009/10/02 (金) 14:25:21 - キバラ >あきら様 かなり遅くなってしまいましたが、返信ありがとうございます。 大腸菌はOD260が0.6〜0.8になったところでOn iceで止めています。生育相ごとにサンプルしてみるのはたしかにいいかもしれませんね・・・ それにしても一ヶ月たった今でもまともに50Sが精製できません。ほかのstrainだとできたプロトコルでもだめってことはやはり大腸菌固有のものなのかもしれません・・・。ただribosome profileは2つのピークのみでいたって正常なうえ、この上なくサブユニットを示しているようなのが分かりません。もし70Sから分離できていないならprofileで3つ見えてもいいものなので・・・。30Sは精製できているのでいったいなにがなにやら・・・・。

リボソーム回収時期 削除/引用 No.1089-2 - 2009/08/26 (水) 15:37:28 - あきら リボソームの回収時期はどうでしょう？ リボソームは定常期に入ると100S（だった？）とか形成してしまうし． 生育相ごとにグラディエントの分画をとってやって、 条件を設定するといいと思います． RNAの件は興味深いですね． サブユニット比とRNA比が一致するんですかね？ 単に70Sの精製がうまくいってないだけだと アレですが、本当なら面白いと思います．

リボソームサブユニットの調整法 削除/引用 No.1089-1 - 2009/08/23 (日) 07:24:22 - キバラ いつも勉強させていただいてます。 今バクテリアのリボソームサブユニットを調整しているのですが、どうしても50S（大サブユニット）が綺麗に大量に調整することができません。どうしても30Sとの混じり物になってしまいます。30Sがくっついてしまっているのかと思い、マグネシウムの濃度をできるだけ厳密に1mMに調整したスクロース溶液で勾配(10-30%)を作って超遠心しても駄目でした。そこで一段階前のステップで調整する70Sをフェノクロで処理してアガロースでrRNAを確認してみたところ、なぜかこの段階で16Sの方が強いバンドをしめしていて、23Sは異常に弱いことが分かりました。そこでtotal RNAを調整してrRNAを確認してみるといつもどおりのrRNAバンドを確認できました。 この場合、70Sを調整する段階で23Sが分解を受けてしまいピュアな50Sがとれないということなんでしょうか？それとも50Sが乖離してしまいどっかにいってしまったということでしょうか？とすると、30S濃度も同様に低くなるはずですが・・・・ 現在使っている大腸菌はwild　typeではなく、MRE600というやつなのですが、どなたかこのstrainを使ってサブユニットを調整した経験がある方がいればアドバイスいただければ幸いです。サブユニット調整法は、Ribosome and protein synthesisという本の調整法に沿った方法を使っています。もし必要であればプロトコルを書きますので、アドバイスよろしくお願いします。

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