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(無題) 削除/引用 No.1061-5 - 2009/08/19 (水) 03:49:23 - IN 横からすみません。少し教えてほしいのですが、 モデル系でHEK293がよく使われるのは、培養が簡単でトランスフェクションの効率がいいからということの他に何か理由がありますか？ 293は上皮細胞とは言え腎臓ですし、HeLaなど他の簡便な細胞があまり使われていないのに何か理由があったら教えてください。

あ”・・・すみません、一箇所、訂正です。。 削除/引用 No.1061-4 - 2009/08/19 (水) 02:02:12 - 月詠 レポーターアッセイ用の強制発現系で発現させなければいけないのは、TLR4および”MD2”（＋レポーター遺伝子）でした。私、何書いてるんだろ。。。＞＜ HEK293細胞は、TLR系の発現に関してはnullですが、MyD88以下のシグナル伝達系の発現は構成的のようですので、TLR遺伝子（＋レポーター遺伝子）だけを強制発現させればレポーターアッセイ系としてワークします。また、ヒト由来の細胞株ですが、マウスのTLR遺伝子を発現させても、MyD88以下の下流のシグナル系は問題なく作用するようです。 LPSに対する応答を観察する場合は、CD14を共発現させた方がLPSに対する感受性がよくなるかもしれません（つまり、より低濃度のLPSを感知できるようになる）。

(無題) 削除/引用 No.1061-3 - 2009/08/18 (火) 22:57:16 - DC 基本的には月詠さんのご意見に賛成です。 ただ、TLRリガンドになりうる「何かしらの刺激」を細胞へ与えた際のレスポンスをハイスループット的にスクリーニングしたいのであれば、多少準備が面倒ですが炎症性サイトカイン（たとえばTNF-α）プロモーターの下流にLucを付けたレポーターアッセイ的な系を準備しておいた方が簡便ではないかと思います。 培養上清のELISAでもいいですけど、これは少し値が張るので・・・ いずれにしても、私が挙げた方法はあくまで「最初の当たりをつける」ための実験系です。これであたりがついたリガンド候補の裏を取る検証実験は他に準備して、本当にそのリガンドTLRリガンドとして機能しているかどうかを証明する事が重要だと思います。当たりをつける実験はある意味、多少穴があってもいいとは思います。候補さえ絞れればいいはずなので。 また、私の勉強不足かもしれませんが、TLRシグナルの下流にTRAILなんて関与しているんですか？TRIFの間違いではないでしょうか。余計なことを申してすみませんが、ひっかかってしまったもので。 実験、頑張って下さい！

刺激がTLR依存的であることは、どうやって立証されるのですか？ 削除/引用 No.1061-2 - 2009/08/17 (月) 20:45:24 - 月詠 もっとも一般的な方法は、マウス腹腔滲出マクロファージを用いて、最終的な細胞応答である培養上清への炎症性サイトカイン(TNFαやIL-6、IL-12p40など）やタイプＩインターフェロン（IFN-β）産生をELISA法を用いて測定することです。最終的な細胞応答を指標とするためスクリーニング法としても最も確実ですし、安価かつhigh through putな方法でしょう。 次が、NF-κB（MyD88経路およびTRIF経路）ないしIRF3（TRIF経路）などの転写制御因子の核内移行をEMSA法ないし蛍光顕微鏡観察などで確認する方法です。このレベルでの活性検出はTLR4およびMyD88を強制発現させたHEK293細胞などを用いたレポーターアッセイで代用可能で、その系を確立する方がスクリーニングには適していると思います。 また、ウェスタンブロット法によるTLR4下流の細胞内シグナル伝達因子のリン酸化検出は、上記スクリーニング法で引っかかってきたリガンド候補が、本当にTLR4依存的にシグナル経路を活性化しているか検討する際に用いた方が効率的かと思います。 ただし、IRAKのリン酸化はIL-1RやIL-18R下流でも誘導されますし、NF-κBの核内移行や炎症性サイトカイン産生は他の経路によっても誘導されますから、必ずしもTLR4を介した刺激のみを反映しているとは限りません。ですので、いずれレベルでの検出においても、「ある種の刺激」が、本当にTLR4を介して細胞を刺激しているのか否かについては、TLR4欠損型細胞やMyD88欠損型細胞などを用いて検証する必要があります。

TLR signal 削除/引用 No.1061-1 - 2009/08/17 (月) 17:24:22 - TLR Toll like receptor signalに関して研究を始めたばかりのものです。 LPSなどのLigandがTLR4に結合した際にMYD88、TRAIL、IRAK１、IRAK２などがその細胞内シグナルの伝達物質として重要と思われるのですが、実際にこの伝達経路が活性化しているのどうかを検討する手段を検討しています。 ある種の刺激がTLRを刺激し得るかを検討したく、Screening的に、ある程度high through putに行えないものかと思っています。 現時点ではpIRAK-1のwestern blotが現実的かと思っているのですが、そのほか何かいい手法、（良い抗体（細胞種はマウスです）など）、情報頂けたら幸いです。

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