全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1057-5 - 2009/08/18 (火) 11:09:17 - MMU 皆様貴重なご助言有り難うございました。 おおさんの仰るとおり、二通りのプライマーを注文し PCRをやってみることにします。先ずは、mutationが入った プラスミドが出来ないと先にはすすめませんので。 まだまだ勉強不足でcodon plusの大腸菌が販売されていることも知りませんでした。 もし通常のBL21で発現量が悪ければ試してみたいと思います。

Codon usage 削除/引用 No.1057-4 - 2009/08/17 (月) 14:09:13 - まうす Rare codonが多いと、翻訳が途中で止まった産物が、精製後にも多量に残存して、実験に影響します。Codonを変えることや、Codon plusの大腸菌を使えば問題は解決します。私の場合は、目的遺伝子のC末端側にも精製用のタグ(His)を導入して、N末端のGSTとC末端のHisの両方で精製することで、全長のタンパク質を回収しました。 Codonを変えることや、Codon plusを使うことの利点としては、より大量に目的タンパク質を得られることです。 量より質なら、上述のC末端側の精製タグも検討してみては如何でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1057-3 - 2009/08/17 (月) 12:05:48 - qwerty 変異を入れる前のタンパク質は大腸菌で大量に発現しているのでしょうか？　その中のArgが頻度の低いコドンも使われているなら、あまり気にしなくていいでしょうし、もし、発現量があまり高くなくて、出来るだけ発現量を下げたくない、という状況なら、高いコドンを使っておけば良いのではないかと思います。 多少ミスマッチが増えても、5'3'両サイドを十分な長さで合成しておけば大丈夫かと。 お世話になっている人のアドバイスなら聞いておいた方が良い、という見方も出来るかと。

(無題) 削除/引用 No.1057-2 - 2009/08/17 (月) 08:39:19 - おお たとえば、あるタンパクを大腸菌で作るためにcDNAを得たとします。 まずずべてコドンをみて、頻度の高いものに変換して大腸菌よう 発現ベクターを作る人は少ないと思います(だからといって そのストラテジーを否定するわけではありません)。 なので、使用頻度の高いコドンに変える手間をどう考えるかという ことに尽きると思います。 しかしながら、レアーコドンtRNAを供給することで非常に改善された という例もありますので、できないなら無視しろと簡単にいえるものでも ありません。 各社タンパクさんせい用の大腸菌を調べると分かると思いますが、 上記に書いたように、cDNAのコドンを変換するのではなく、大腸菌に レアーコドンに対するtRNAを補給したものがうられていますので そちらで対処する手はあると思います。 で私なら、プライマーを１セット余分になるくらいですむなら、 両方やってみます。目的のクローンがとれる取れない、または 機能する機能しないとか、大腸菌で安定だとか安定でないとか、 PCRがかかりやすいとかかかりにくいとか、、 いろいろ理屈上よく分からないこともおきますので、 複数の方法を持つのは得策であろうと思っているからです。

プライマー設計の際コドン使用頻度を考慮すべきか？ 削除/引用 No.1057-1 - 2009/08/17 (月) 08:01:42 - MMU このフォーラムで初めて質問させて頂きます。タンパク質も少し扱う材料系の研究室に所属し、最近バイオ実験の世界に足を踏み入れた初心者です。 今回は、プラスミド(pET-30a)にinsertされているタンパク質DNAに対してPCRを用いてmutationを施す場合、プライマーの設計に際して大腸菌のコドン使用頻度を考慮する必要があるか否かについてお教え下さい。 具体的には、アミノ酸140個くらいからなるタンパク質中に含まれる10個のLysを全てArgに改変する予定です。Lysのコードはaaaかaag、Argのコードはaga、agg、又はcgnですので、プライマー中にagaかaggを使えばテンプレートDNAとのミスマッチが少なくて済むと考えました。 しかし、実験を指導して頂いているラボテクニシャンから、Codon usage table というものを示され、agaやaggは大腸菌における使用頻度が低いので 頻度が高いcgtやcgcを使ってプライマーを設計すべきであると指摘されました。（agaやaggの頻度はcguやcgcの約1/10-1/20) 一方、分子生物学の研究室に所属している友人にこれを話したところ、 彼いわく、コドンの発現頻度を考慮する必要はなく、むしろミスマッチを少なくすべきとのことでした。 コドンの頻度を考慮するべきか否かは、もしかすると最終目的によるのかもしれません。私の実験では、mutationを施したDANが得られれば、次にそれを大腸菌(BL21)に導入して目的のタンパク質の大量発現とその精製を試みる予定です。 このような場合、コドンの発現頻度を考慮してプライマーを設計すべきか、それともミスマッチを少なくすることがより重要か、ご教示頂きたくよろしくお願い致します。

全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---