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(無題) 削除/引用 No.1056-9 - 2009/08/26 (水) 11:21:08 - rrrh 試薬はマイクロスピッツに分注して-20度で保存してありました。 ソーティング前の細胞にも試しましたが、同様でした。 今回incubation時間を延ばすことで、スパイク状のラベルはできたのですがかなり細胞数も減少し、シグナル減衰も見られませんでした。 ちょうどストックもなくなり、試薬は買いなおして試してみます。

(無題) 削除/引用 No.1056-8 - 2009/08/20 (木) 00:06:45 - Kazu 1-2年前に何回か凍結、融解を繰り返したのであれば、試薬がだめな可能性は十分あるので、お金があるなら早く新品を買った方がいいような？ ソーティングに問題はないと思いますが、ソーティング前のリンパ球でCFSEを試されましたか？

(無題) 削除/引用 No.1056-7 - 2009/08/19 (水) 21:14:48 - ami ＞CFSEはずっと４℃で遮光保存していたのですが、 経験的に、分注後に１回４度とか融解とかしたものはかなりへぼくなります。２回するとぼちぼちへぼくなります。１回分の量にして−２０とか−８０しておくのがいいです。

(無題) 削除/引用 No.1056-6 - 2009/08/19 (水) 18:42:26 - hyya 細胞の良し悪しに関しては不明ですが、私も CFSE解析がうまくいかないことがありました。 私の場合は細胞は増殖していると思われるのに、 CFSEのシグナル減退が観察されないというものでした。 CFSEはずっと４℃で遮光保存していたのですが、 いくらやってもうまくいかないので、−８０℃にストック してあったものを使用すると、FACSでうまくピークの 減退を観察することができました。それからは、CFSE解析は 一度使用したものは破棄しています。

(無題) 削除/引用 No.1056-5 - 2009/08/19 (水) 08:24:51 - rrrh アドバイスありがとうございます。 蛍光のピークが緩やかなだけではなく、弱かったです。 incubation時間を延ばして細胞が減少するのを恐れていたのですが、まずはincubation時間を延ばしてみます。 ソーティングしたマウスリンパ球を用いており実験系は同一、lotも同じものを使っています。逆に1-2年前のものなので試薬の劣化を心配していました。 質問なのですが、viabilityが悪いとやはり取り込みも悪いのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1056-4 - 2009/08/18 (火) 23:00:21 - DC 実験系も全く一緒なのでしょうか。細胞や試薬のLotなども一致していますか？ 細胞種が異なればCFSE染色のプロとコールも一部異なってきます。 また、細胞の活きもかなり染色に影響するように思います。 CFSE染色する際に回収した細胞のViabilityはいかほどでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1056-3 - 2009/08/17 (月) 11:07:01 - おお ラベルが不十分なのでは、、、 例えばラベルの時間を長くすると取り込みの量とかかわりますか? あと昔の人がやっていたと書いていますが、生データーに近いものが 残ってますでしょうか?得られている蛍光の強さとか参考になるかもしれません。 ノートとかあれば細かい方法についてもチェックできるかもしれません。

http:// 削除/引用 No.1056-2 - 2009/08/17 (月) 03:26:57 - TK-1 何を持って、一般的なプロトコールと異なるとおっしゃっているのかわかりませんが、一般的なプロトコールとはかなり異なっていると思っていて、さらに実験がうまくいかない、あるいはトラブルシュートが出来ないのなら、一般的なプロトコールを使われたらよろしいと思います。そうすれば、劣化なのども可能性も判断できるんじゃないでしょうか。

CFSE 削除/引用 No.1056-1 - 2009/08/17 (月) 02:12:29 - rrrh 細胞増殖を調べるために、CFSEで標識をしております。 しかしラベリンングした直後でもFACSのヒストグラムが鋭いピークを描きません。 最終濃度５μMで室温8分のincubation後３回mediumで洗浄しております。 一般的なプロトコールとはかなり異なりますが、以前した人はうまく行ったとのことです。 CFSE添加後は速やかに混ぜ、遮光しています。 stockが劣化しているのか、やはり温度や時間がよくないのか、いろいろ考えておりますが、アドバイスいただければ幸いです。

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