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(無題) 削除/引用 No.1054-17 - 2009/08/21 (金) 14:26:54 - むらさき >[Re:15] ちろるさん 返信ありがとうございます。 Hyg200ですか。それは凄く濃いですね。 私の用いているディスティネーションベクターもKanとHygで選抜できるようですので Hyg濃度を濃くしたプレートと今までのプレートの両方で試してみることにします。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1054-16 - 2009/08/21 (金) 14:22:39 - むらさき >[Re:14] heimlichさん 返信ありがとうございます。 15~16時間かかっても問題なさそうで安心しました。 PCRのやり直しは、してみようと思います。 バキュロウィルスのDH10Bacやタンパク発現のBL21以外では、 私の研究室では常にDH5αに入れています。 その他の大腸菌があるのかを確認して、 あるのであれば試してみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1054-15 - 2009/08/21 (金) 13:01:39 - ちろる 3-フラグメントの組み換えをgate wayでやってます。 以前似たような問題があったので参考までに。 形質転換後にコロニーPCRをすると目的のバンドが得られるのに、プラスミド取ってシーケンスすると読める配列は3-フラグメントのうちのどれかだけ。試しにエントリークローンを大腸菌に入れてHygのプレートで選抜したところ、コロニーが沢山でました…。 何が言いたいのかというと、Hygの濃度が薄くてバックグラウンドのコロニーがばんばん生えてきてて、それを拾ってる可能性もあるんではないかと。 Invitrogenでは50-100ug/mlを推奨してますが、うちでは最終的にKan 50ug/ml,Hyg 200ug/mlのプレートで選抜することで当たりのコロニーだけ拾うことが出来ました。 新品のHygでも濃度が薄いとだめだったので、Hygは濃いめがいいのかなという印象。 あくまで参考までに。

(無題) 削除/引用 No.1054-14 - 2009/08/21 (金) 12:46:17 - heimlich 形質転換が不成功なら、生えてこないだけでしょう。 pLenti7.3を用いて、レンチウィルスを作っていますが、その時はcolonyが見えるようになるまで大体15〜16時間くらいかかります。 おそらく、プラスミドが大きいため、増殖スピードが遅いのだと思います。 selectionがかかっているとすると、組み換えはおっしゃる通り起きている可能性が高いと思います。とすると、形質転換後、plate上で増殖中にmutationが入っているor欠失がおきている、もしくはPCRのプライマーが他のものを増幅しているか。 ご使用の大腸菌の種類を変えるのも一つかと思います。Invitrogen社のStbl3は、レンチウィルス用の大腸菌で、組み換えが起きにくいとうたっています。 ただ、以前Clontech社のpAdeno-X expression systemでアデノウィルスを作成した時は、これに入れると収率は低いし、制限酵素での確認では、目的外のバンドが何本も出て…。ただ、目的のバンドも入っていたので、DH5αにしたら、とてもうまくいきました。プラスミドによっては、大腸菌との相性もあるので、一度大腸菌を変えるのもいいかもしれません。（Stbl3は、レンチウィルスではいい感じです。）

(無題) 削除/引用 No.1054-13 - 2009/08/21 (金) 11:19:54 - むらさき >[Re:12] heimlichさん お返事ありがとうございます。 私も組み換えが起こらなかった可能性を考えたのですが、 pENTRがKan耐性、ディスティネーションベクターがHyg耐性で Hygのプレートで選抜していますので、組み換えが起こらないと生えて来ないと思っています。 →ここから、組み換えは起きていると思いました。 　また、コロニーが出来るなら形質転換も出来ているのでは？と思いました。 形質転換がうまくいかなかった場合、コロニーが生えない以外の現象があるのでしょうか。 確かに、形質転換後16時間程度経たないとコロニーは生えませんでした。 あと、生え方も普段のコロニーとは異なりました。 コロニーPCRの結果は、挿入断片の増幅は確認出来ましたが、 attB1-attB2でのプライマーでは、目的断片の他にも断片が増幅され２本のバンドになってしまいました。 ディスティネーションベクターの配列が不明なため、attB1-attB2で作ったプライマーが その他の場所に結合してしまった可能性もあるのかもしれませんが・・・ もう一度、一つ一つを確認しながら試してみます。 また、プロモーター領域のプライマーなどを用いてPCRをしてみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1054-12 - 2009/08/20 (木) 14:39:42 - heimlich 前述の話は、組み換えが起こらずにそのまま形質転換したらという想定でしました。 現時点では、組み換えがうまくいってないのか、その後の形質転換がうまくいってないのかわからない状態ですので、まずはそこをはっきりするようにしたほうがいいと思います。 方法としては、組み換えがもしうまくいっているなら、反応後attB1-GOI-attB2という配列に変換しているはずなので、ここをターゲットにしたPCRもしくはシークエンスを見るのはいかがでしょうか？ また、プラスミドと大腸菌には相性がありますので、大腸菌の種類を変えるのもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1054-11 - 2009/08/20 (木) 14:04:56 - むらさき >[Re:10] ばいやさん 返信ありがとうございます。 プラスミドの配列情報があれば安心なのですが、 ディスティネーションベクターの配列情報を取得出来ていないのです。 相同組み換えの後のディスティネーションベクターが２万bp程なのですが、 大き過ぎて入りにくいということは無いですよね・・・ ２万くらいは普通だと聞いたのですが・・・ 勉強不足だなんてとんでもないです。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1054-10 - 2009/08/19 (水) 13:25:20 - ばいや 私のは本当に初期の頃ですので。それから随分といろいろな種類が出ています。 初めとはrfCの塩基配列が変わってしまいましたしね。 プラスミドの配列情報があれば安心ですね。 勉強不足で3種断片導入方法もあったように思いますし、最近のは知らないです。

(無題) 削除/引用 No.1054-9 - 2009/08/19 (水) 12:05:21 - むらさき >[Re:7] ばいやさん お返事ありがとうございます。 私が拝見したHPではXhoI消化と記載されていました。 google検索で、「gateway XhoI」で検索すると一番上に出てくると思います。 なぜか、私のパソコンではPDFとして開けないので、 アドレスを記載できなくて申し訳ありません。 これを参考にしたのは、pGWBを使う時はXhoI消化してください。 との記載があったからです。 上記しましたHPにもリニアでの効率が高いの記載がありました。 リニアで出来れば問題はないのですが、 ばいやさんのおっしゃいます様に、私自身もXhoI消化での断片について 分からない点がありすぎて、困っていました。 その他の制限酵素についても調べてみます。

(無題) 削除/引用 No.1054-8 - 2009/08/19 (水) 11:57:43 - むらさき >[Re:6] heimlichさん お返事ありがとうございます。 proteinase K処理はしています。 XhoI処理後のselectionまで教えて頂きありがとうございます。 これは、リニアな状態で形質転換を行うということで間違いないですか？ pENTR 4に関しては、 ttp://tools.invitrogen.com/content/sfs/vectors/pentr4_dual_selection_vector_map.pdf こちらのHPからvector mapが見れると思います。 ttp://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&productID=A10465&CID=Search-Product これが大元のHPです。 ディスティネーションベクターは、pABH-Hm1をbackboneとして 作られたものなので、vector mapはinvitrogenにはありません。 こちらもCmrとccdBがattR1とattR2に挟まれているので、 組み替え後の選抜は可能です。

(無題) 削除/引用 No.1054-7 - 2009/08/19 (水) 10:10:58 - ばいや 初期の頃にしか使ったことがないですが。 XhoIではなくXbaIの間違いでは？ CmとccdBの間で１カットで切れるものです。カセットは3種あり、MluI、BglII、XbaIでそれぞれ切れます。XhoIでは変なところを切断している可能性があります。 切断しなくても大抵大丈夫ですが、できにくいものなんかはリニアにしていると確率は断然違います。ccdBなんかに変異ができて増えてきたのもあったし。 大量処理をしていたので、個別対応をあまりしたくなかったので初めからリニアにしていました。

(無題) 削除/引用 No.1054-6 - 2009/08/19 (水) 06:46:06 - heimlich ソースとは、情報源という意味で使いました。混乱させて申し訳有りません。 rapid BP-LR反応の話は、GOI→BP反応→proteinase K反応→LR反応と続けていけるので、XhoI処理は不要という証左で用いました。 ちなみに、その実験をされた方は、LR反応後proteinase K処理はされたのでしょうか？ これをしないと、効率が落ちると思うのですが。 あと、XhoI処理後のselectionについてですが、制限酵素処理で薬剤耐性が切れるのであれば、それで選別できますし、vectorによっては、ccdB geneが入っているので、未変換のものはこれで除外されます。ちなみに、お使いのvectorは、Invitrogen社のvector mapに載っていませんが、どこのものでしょうか？Gateway technologyって、Invitrogen社が特許を押さえていて、他社は販売していないと思っていたのですが、違うのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1054-5 - 2009/08/18 (火) 17:22:31 - むらさき >[Re:3] tmさん お返事ありがとうございます。 そうです。単純に乗せ換えるだけなので、私もXho I消化は必要ないと思っていました。 実際には、後輩がこの操作を担当しているのですが、そのまま反応させると出来なかった様なのです。 Xho I消化後のことは、まだ確認出来ていないのですが、 消化してしまうと環状プラスミドでは無いため、組み換えの有無を選抜出来ないのでは？と 私は思っています。 そこで、本当に消化する必要があるのか？と思い、質問させて頂きました。 使用しているのは、pENTR 4 vectorとpKI-GWB2で、LRクロナーゼのmixを使用しています。 単純に混ぜてインキュベートで普通は出来るものなんですね・・・ カタログやHPは参考にしていますが、Xho I消化の必要性を考えていたので それだけでは理解できませんでした（InvitrogenにはXho I消化について記載が無かったので）。 ですが、消化せずに出来るのであれば、問題ないです。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1054-4 - 2009/08/18 (火) 17:17:12 - むらさき >[Re:2] heimlichさん お返事ありがとうございます。 申し訳ありません。ソースとは何のことでしょうか？（このようなレベルの学生です） 使用しているものは、InvitrogenのpENTR 4 Dual Selection Vectorで、 制限酵素を用いて断片を挿入しました。 なので、BP反応は必要なく、LR反応だけを必要としています。 LR反応のディスティネーションベクターは、pKI-GWB2というものです。 Invitrogenでは講習会も行っているのですね。一度調べてみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1054-3 - 2009/08/17 (月) 18:42:54 - tm 単純にエントリーベクターからLR反応でデスティネーションベクターに乗せ換えるだけですよね？通常のLR反応でXhoI消化するというのは聞いたことがないです（自分が知らないだけならごめんなさい）．これまでに何十回とエントリーベクターからLR反応で乗せ換えをしていますが，XhoI消化したことはないです．普通にプロトコル通りにやって失敗したことは1度もないですし，拾ったクローンはほぼ100％乗せ換えがうまくいっています（プロトコルと違うと言えばけちって反応系を4μlとかでやっていることぐらいです）．ですので，自分的にはLR反応はすごく安定した（まず間違いなくうまくいく）反応という認識なのですが．普通とは違う系なのでしょうか？XhoI消化するとうまくいってるのでしょうか？？？ ちなみに私がよく使うのは，エントリーベクターはpENTR/D-TOPOで，デスティネーションベクターはいろいろ使いますが哺乳類細胞用ならpEF-DEST51とかpcDNA3.1とかです． invitrogenのカタログにもおおまかに解説が出ていた気がします（おそらくwebにもあるのでは？）．それを見れば，エントリーベクターにはattL-gene-attL，デスティネーションベクターにはattR-ccdB-attRがあって，LR反応はattLとattRの間で組換え反応が起きて，結果としてattB-gene-attBというデスティネーションベクターが出来上がる（残りはattP-ccdB-attP），ということが図示されていると思うのですが，これでは参考にならないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1054-2 - 2009/08/16 (日) 06:02:06 - heimlich 自分は、Invitrogen社のViraPowerでレンチウィルスを作りましたが、制限酵素処理はせずに、組替えは成功しました。 そのプロトコールでは、rapid BP-LR reactionとして、BP反応からtransformを経ずに連続してLR反応に行くものも記載されていたので、Xho�T処理は基本的に不要だと思いますが。 ちなみにソースを教えていただけませんか？BP反応に関しては、linearizedなものの方が、組替えはおきやすいという記載はありました。 なお、Gatewayに関しては、Invitrogenの解説書および講習会レベルの知識しかありませんが、特定の配列を認識して、その配列にはさまれた領域を組替え（交換）する酵素という認識です。これを応用したのが、Flip-in,Jump-in systemだと思います。もし、余裕があれば、Invitrogen社の講習を聴講するもしくは関連文献を教えてもらうのがいいのではないでしょうか？

gateway LR反応について 削除/引用 No.1054-1 - 2009/08/15 (土) 13:39:01 - むらさき はじめまして。 現在invitrogenのgateway pENTR vectorに目的遺伝子を挿入したものと 頂いたディスティネーションベクターを用いてLR反応を行っています。 そのLR反応について質問です。 ◎gateway LR反応として色々と検索してみると ディスティネーションベクターをXho I消化した後、LR反応に用いる。 という記述が見られました。 実際、Xho I消化せずにLR反応を行った際には、コロニーは殆ど得られず 得られたコロニーも目的の組み換えが生じていませんでした。 １．Xho I消化しなくてはならない理由は？ ２．Xho I消化した場合、LR反応後にはプラスミドになっている？ この二点が疑問点です。 またgatewayについて、invitrogenの資料を読んでもいまいち理解できないのですが 何か参考にできる本などご存知の方いらっしゃいましたら 教えて頂けると嬉しいです。 宜しくお願い致します。

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