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(無題) 削除/引用 No.1052-12 - 2009/08/18 (火) 16:50:00 - orz Lipofectamine LTXはどうですか？ かなり大きなサイズもいけました

(無題) 削除/引用 No.1052-11 - 2009/08/18 (火) 11:33:32 - Tb 情報、よろしくお願いします。 ところで、ウイルスさん＝ステップさん＝Tak1さん、なのですか？ 話は通じてますすが。。。 もうひとつ、transfection試薬は何でしょうか？別にいいアドバイスがでるわけではないですが、興味かあるので教えてください。

(無題) 削除/引用 No.1052-10 - 2009/08/18 (火) 10:56:30 - tak1 >[Re:9] Tbさんは書きました : > 誤記すいません。pMBNでなくてpBMNですね。 > > > EBNA-1がpBMNに組み込まれたLZRSというベクターを使っています。 > こういうのがあるとは知りませんでした。Nolan LabのWebと論文あたって勉強させて頂きます。やっぱり、pBMNより高タイターが出せるのですか？ EBNA-1の入っていないベクターと同じ条件で比べたことがないのでわかりませんが、マウスの骨髄細胞には割と良く入ります。 phoenix-amphoがもらえたのと、pQCIXに乗せ変えているので、どっちが良いか比べてみます。 タイターとGFPの蛍光強度、どっちがいいか比べてみます。

(無題) 削除/引用 No.1052-9 - 2009/08/17 (月) 20:38:59 - Tb 誤記すいません。pMBNでなくてpBMNですね。 > EBNA-1がpBMNに組み込まれたLZRSというベクターを使っています。 こういうのがあるとは知りませんでした。Nolan LabのWebと論文あたって勉強させて頂きます。やっぱり、pBMNより高タイターが出せるのですか？

(無題) 削除/引用 No.1052-8 - 2009/08/17 (月) 08:33:11 - ステップ >[Re:7] Tbさんは書きました : > ところで、 > > PhoenixシステムのレトロGFP発現ベクター > というのはpMBN-IG vectorですよね？念のために確認なんですが、amphopack-293でうまくいかなかったplasmidはPhoenix-Ecoでうまくいったplasmidとまさに同じチューブ（ロット）のものですか？ pMBN vectorは癖があって、コロニーの生育が早いものからすごく遅いものまでおそろしばらつくし、コロニーつついてもある確率でミニプレップで増えてこなかったり、ミニプレップでプラスミドを確認しても続いてのラージプレップで短いもの（recombination？）になってたり、なんにもplasmidがとれなかったりで、なんか扱いにくいと感じてました。（なのでもう使ってません。）ですので、失礼ながらそのplasmidが大丈夫か質問です。 EBNA-1がpBMNに組み込まれたLZRSというベクターを使っています。 確かにクローニングが難しく、増殖も遅く当たりは必ず小さいコロニーです。そしてたまに短くなります。多分、レンチウイルスベクターでも見られるLTRの組み替えだろうとと思っています。 プラスミドプレップごと、制限酵素と電気泳動で一応確認してはいるのですが。。。

pBMN vectdor 削除/引用 No.1052-7 - 2009/08/17 (月) 06:50:55 - Tb ところで、 > PhoenixシステムのレトロGFP発現ベクター というのはpMBN-IG vectorですよね？念のために確認なんですが、amphopack-293でうまくいかなかったplasmidはPhoenix-Ecoでうまくいったplasmidとまさに同じチューブ（ロット）のものですか？ pMBN vectorは癖があって、コロニーの生育が早いものからすごく遅いものまでおそろしばらつくし、コロニーつついてもある確率でミニプレップで増えてこなかったり、ミニプレップでプラスミドを確認しても続いてのラージプレップで短いもの（recombination？）になってたり、なんにもplasmidがとれなかったりで、なんか扱いにくいと感じてました。（なのでもう使ってません。）ですので、失礼ながらそのplasmidが大丈夫か質問です。

(無題) 削除/引用 No.1052-6 - 2009/08/17 (月) 06:31:44 - Tb TK-1さん、通りすがりさんが書いているように、GFPが出ていないならtransfectionの問題ですよね。プラスミドによって効率がそこまで変わるのか確かに不思議ですが･･･　その細胞・そのプラスミドで濃度・比率を振って最適化を測ってみる、transfection試薬を変える、とか。ちなみにどんなtransfection法を使っているのでしょうか？ でも、Phoenix-Amphoに乗り換えができるのならそれが楽そうです。

(無題) 削除/引用 No.1052-5 - 2009/08/16 (日) 14:24:08 - ウイルス pQCXIはクロンテックのCMVプロモーターベクターで、これとGP２−２９３の組み合わせだとうまくいくのですが、発現用プラスミドはすべてLZRSで作ってあって、どうしようかと思っていました。 とりあえずPhoenix-amphoで試して、pQCXIに乗せかえも考えておく、というのが良いでしょうか。 >[Re:4] 通りすがりさんは書きました : > 由来が同じ293でも、継代数が代われば細胞の性質がかなり違ってくることはよくあります。トランスフェクション効率がPhoenix-ecoよりも低くなっている可能性が高いように思えます。導入条件を色々変えて試してみる、発現効率の高いinternal promoterでdriveするレトロベクターに変えてみる(pGCIXがどういうベクターかしりませんが、これがレトロベクターならこちらに乗り換えてみては？）、他のampho-packgaing cellに変更する(workしているラボから譲り受ける）など、いかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1052-4 - 2009/08/16 (日) 13:28:16 - 通りすがり 由来が同じ293でも、継代数が代われば細胞の性質がかなり違ってくることはよくあります。トランスフェクション効率がPhoenix-ecoよりも低くなっている可能性が高いように思えます。導入条件を色々変えて試してみる、発現効率の高いinternal promoterでdriveするレトロベクターに変えてみる(pGCIXがどういうベクターかしりませんが、これがレトロベクターならこちらに乗り換えてみては？）、他のampho-packgaing cellに変更する(workしているラボから譲り受ける）など、いかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1052-3 - 2009/08/15 (土) 14:24:41 - ウイルス >[Re:2] TK-1さんは書きました : > packaging cellでGFPが発現しないのであればtransfectionの問題では？細胞のストックの問題か、mycoplasmaとかその辺の問題はないのでしょうか。 > transfectionに問題があればウイルスは出来ません。 pQCIXとGP2-293、LZRS-Phonixの組み合わせでトランスフェクションするとGFP+がたくさん出て来るのですが、LZRS-GP2-293の組み合わせが全くダメなので細胞自体がおかしい、ということはないと思ってます。Phoenixも293ベースなので、トランスフェクションでそこまで差が出るか？と思っているのですが。。。

http:// 削除/引用 No.1052-2 - 2009/08/15 (土) 11:40:51 - TK-1 >[Re:1] ウイルスさんは書きました : > PhoenixシステムのレトロGFP発現ベクターをamphopack-293やGP2-293+VSV-Gにトランスフェクションしているのですが、ウイルスが出来てくれずパッケージングセルもGFPを発現してくれません。Phoenix-Ecoにトランスフェクトした場合は、7、8割のパッケージングセルがGFP+になり、高いタイターのウイルスがとれます。。。タカラのサポートも出来るはず、と言っていたのですが、根本的に何か足りないところがあるのでしょうか？ > > どのメーカーのレトロウイルス発現ベクター(LTRで挟まれたORF)とパッケージングセル(gag, pol, env/VSV-G発現）の組み合わせでも、基本的にはウイルスは出来るはずですよね？ > タカラからはPhoenixは293Tベースでクロンテックは293ベースだから、GFPタンパクの発現量が低いだけでウイルスは出来るはず、と言われたのですが、上清にウイルス活性がありません。アドバイスをもらえましたら助かります。 packaging cellでGFPが発現しないのであればtransfectionの問題では？細胞のストックの問題か、mycoplasmaとかその辺の問題はないのでしょうか。 transfectionに問題があればウイルスは出来ません。

レトロベクターとパッケージングセル 削除/引用 No.1052-1 - 2009/08/14 (金) 19:14:04 - ウイルス PhoenixシステムのレトロGFP発現ベクターをamphopack-293やGP2-293+VSV-Gにトランスフェクションしているのですが、ウイルスが出来てくれずパッケージングセルもGFPを発現してくれません。Phoenix-Ecoにトランスフェクトした場合は、7、8割のパッケージングセルがGFP+になり、高いタイターのウイルスがとれます。。。タカラのサポートも出来るはず、と言っていたのですが、根本的に何か足りないところがあるのでしょうか？ どのメーカーのレトロウイルス発現ベクター(LTRで挟まれたORF)とパッケージングセル(gag, pol, env/VSV-G発現）の組み合わせでも、基本的にはウイルスは出来るはずですよね？ タカラからはPhoenixは293Tベースでクロンテックは293ベースだから、GFPタンパクの発現量が低いだけでウイルスは出来るはず、と言われたのですが、上清にウイルス活性がありません。アドバイスをもらえましたら助かります。

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