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(無題) 削除/引用 No.1050-7 - 2009/08/15 (土) 19:27:58 - AP >この膜タンパク質の分離を試みておりますが、 >当研究室には、超遠心分離装置が無く、通常の遠心(数万G) >では、収率が良くありません。 hoboさんが書かれていますが、超遠心を使うというのは、「膜タンパク質」を沈殿させるのではなく、「膜画分」を沈殿に濃縮する方法ですよね。膜画分を分取してそこからタンパク質を抽出するということなんだと思いますが、 >当方、超遠心装置が無いので、界面活性剤(0.5%TritonX-100)入り緩衝液で破砕（ソニック）し、遠心後、上清をそのまま一時間程度攪拌しておりました。 「収率」が悪いと言っているのは、前段階からの定量値（酵素活性など）を追跡した結果、途中のステップで大幅なロスがあるということが明らかなんでしょうか。この方法では、膜は溶けて膜タンパク質も放出されるので、濃縮はされていない、むしろバッファーで希釈されているわけですが「総収量」としてもロスがあるとみられるのでしょうか。収率（途中段階でのロス）の問題なのか、目的のタンパク質が実用的なレベルまで濃縮できないのが問題か、で対処すべきポイントも違うと思うんですよね。 動物細胞用ですが、超遠心を使わず試薬ベースで細胞成分の分画をするキットもあるようです。試薬の詳細はわかりませんが、細菌でも応用可能な原理かもしれません。 ttp://www.cosmobio.co.jp/product/products_NVG_20040301.asp

(無題) 削除/引用 No.1050-6 - 2009/08/15 (土) 18:26:18 - さすらい研究者 皆様、ご回答ありがとうございました。 ＞hobo様 一般的な教本では、破砕→遠心→上清の超遠心→ペレットに界面活性剤入り緩衝液で可溶化、とあります。 当方、超遠心装置が無いので、界面活性剤(0.5%TritonX-100)入り緩衝液で破砕（ソニック）し、遠心後、上清をそのまま一時間程度攪拌しておりました。 可溶化の検討も再度行ってみます。 皆様にいただいた意見を参考に再度検討を行ってみます。

(無題) 削除/引用 No.1050-5 - 2009/08/15 (土) 00:54:37 - おお >[Re:2] tak1さんは書きました : > Triton X-114という水溶性タンパク質と難溶性タンパクを二層分離できる界面活性剤はどうですか？ > わたしもこの方法をとるかもしれません。ピアスが M-perという商品名だったと思うのですが、たぶんそれを 使った試薬(きっとを売っています)。 あとは、、パーコールとかで出来るかも知れません。

(無題) 削除/引用 No.1050-4 - 2009/08/14 (金) 19:03:14 - tak1 実はサイトゾルと膜画分両方に存在して行ったり来たりしている、とか。。。

(無題) 削除/引用 No.1050-3 - 2009/08/14 (金) 17:43:16 - hobo ご質問の意味がはっきりしないのですが、可溶化のあとの難溶物除去ではなく、膜画分の回収の方法ですか？収率が低いということは、菌体からタンパクが取れてきてないせいか、可溶化が不完全か、どちらかですよね？ただ、どちらも目的物は沈殿に残っているはずですが（分解されてない限り）、いずれでも超遠心があっても解決する問題ではないと思いますけど。

(無題) 削除/引用 No.1050-2 - 2009/08/14 (金) 16:02:43 - tak1 Triton X-114という水溶性タンパク質と難溶性タンパクを二層分離できる界面活性剤はどうですか？ 超遠心機を他のラボに借りたほうがいいとおもいますけれど。

超遠心無しで膜タンパク質を効率よく分取する方法 削除/引用 No.1050-1 - 2009/08/14 (金) 15:47:28 - さすらい研究者 いつも参考にさせていただいております。 現在、細菌から酵素のスクリーニングを行っているのですが、 どうやら目的酵素は膜タンパク質（アンカリングタイプではなく、膜表面にサブユニットタンパクと結合しているタイプ）であるようです。 この膜タンパク質の分離を試みておりますが、 当研究室には、超遠心分離装置が無く、通常の遠心(数万G) では、収率が良くありません。 もし超遠心分離無しで、このようなタンパク質の可溶化について、 ご存知の方がいらっしゃいましたら ご教示の程お願い致します。

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