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訂正 削除/引用 No.1049-6 - 2009/08/14 (金) 16:05:16 - 名無し 訂正）すいません。pH6.8は中性でした。でも室温だとカビはえます。

(無題) 削除/引用 No.1049-5 - 2009/08/14 (金) 15:23:28 - 名無し １.とりあえず現状を 改善のための対策。 サンプルのレーンの縦方向のノイズは不溶物です。コンタミがあったり、調べたい蛋白質がSDS　sample buffer中で完全に可溶化できていないときに起きます。よってお話から察する限りでは、sample自体に原因があるトラブルと思います。SDS-sample bufferを新しく作り直してみて下さい。万全を期すならばできればグレードの高いSDSを新しく購入することを勧めます。できることならbetaMEも新調したほうがいいでしょう。あれもみんなで使っているとだんだん汚れてきます。開封されてから1年以上共通試薬棚にあるような古いSDSや古いsample bufferはゴミやほこり、ケラチンなどがコンタミしやすいのでこうした泳動パタンのトラブルの原因になりやすいです。BPBとbeta MEはストックのsample buffer に入れておくのではなくて、泳動する前にSDS-sampleに必要量だけ直接加えるようにしてみて下さい。泳動前に12000xg, 10min, 15~20Cくらいの条件で遠心して不溶物を除きましょう。上清をとるのに邪魔になるので、BPBはそのあと加えましょう。微細な不溶物は縦方向のノイズの原因になります。 もしSDS sampleをフリーザーに保存していたならば、泳動前によく溶かしましょう。低温でSDSがまだ析出している状態はノイズの原因になります。 余談ですが0.5M Tris-HCl (pH6.8)は長く室温で保存しているとカビが生えます。カビは弱酸性が大好きなのでちょうどいいらしいです。もしsample bufferを作る時にこうしたものを使うなら白い綿みたいなのが浮いてないか確認しましょう。 2. その他一応チェックした方がいい事。 　アプライする蛋白質量について適正な量かどうかオーバーローディングではないか一応考えてみて下さい。適切な蛋白質量はwesternでは大切です。これは自分の見たいタンパク質によるので、いちど濃度を振ってどのくらいが適量かチェックしましょう。 　SDS　sample buffer中の蛋白質濃度が非常に高いとSDS化が不十分になりスメアになったり可溶化が不完全で冒頭に書いたような不溶物によるトラブルにつながります。思い当たるふしがあれば、少なくとも1mg/ml以下になるように、新たにSDSsample bufferを加えて希釈するなどしてみてください。 　 　剪断不十分なDNAの混在（こういう状態のサンプルは粘性がある）は、粘性のため正確なアプライができずレーン間の蛋白質量がバラバラになったり、高分子量領域中心に泳動パタンの乱れや分離不良、部分的な転写不良などを招くことがあります。高濃度の非イオン性界面活性剤の存在はSDS化を妨害することがあります、また植物由来の材料などではSDS-PAGEを乱すような成分が含まれている場合があるようです。もし可能性があれば除去するような前処理を講じる必要があるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1049-4 - 2009/08/14 (金) 14:32:54 - 月詠 同じ試薬を用いて成功するときもあるということですので、毎回、異なっている要因があるとすれば、ゲルを作成する際のガラス板の洗浄の良し悪しではないでしょうか。 微妙な移動度のズレが解析結果に大きな影響を及ぼすロングシークエンス用の分析機器を製作・販売していた某社の技術担当員から教わった話ですが、精度のよいゲル作成の要点は、「とにもかくにもガラス板をよく洗浄する」ことに尽きるということでした。他の点をいくら改善しても、ガラス板の洗浄が不十分だったら台無しになるのだそうです。 それを聞いて以来、ＰＡＧＥ用のガラス板は、毎回、使用直前に、中性洗剤で前回泳動時についたゲルのかすなどの汚れを完全に除去し、蒸留水を濯いだときにどこも水を弾かないくらいキレイにしてから用いるようにしています（ちなみにBio-Rad社製のゲル作成器を用いています）。 それから異常な泳動結果が得られたことはほとんどありません。

(無題) 削除/引用 No.1049-3 - 2009/08/14 (金) 14:18:43 - ~ そのおかしなパターンが見えているメンブレンをポンソーＳなどで染めた場合、たんぱく質のラダーは綺麗に見えるのですか？それともたんぱく質のパターン自体がおかしいのですか？ たんぱく質のパターンが歪んでいるのであれば、ゲルの出来が疑わしいでしょうし、パターンが欠けていたりすれば、トランスファーの方が疑わしいと思います。 >不純物が入る理由もないし 無塵室で作っているわけではありませんよね。実験室も貴方も不純物の混入源でしょう。否定する理由が分かりません。 >ゲルは成功したときの時間配分で作り 温度によってゲルの固まる時間が違いますので、時間だけでコントロールしているのであれば問題が起きてもおかしくないでしょう。 >試薬がよく混ざっていない この話はどこに行ったのですか？ 他の人がきちんと出来ているのであれば、貴方の操作が原因と考えるのが妥当と思いますが… ラボの同僚にやり方を見せてもらうのが解決の近道だと思います。

(無題) 削除/引用 No.1049-2 - 2009/08/14 (金) 14:05:36 - AP >しかし、不純物が入る理由もないし、ゲルは成功したときの時間配分で作り、試薬も、成功したときのものを使っています。 どういうサンプル調製を行ったのか書かれていないので、ほんとうに「不純物が入る理由がない」のか判断できませんが、たとえばゲノムDNAの持込みで、スジがでることはよくあります。また、ゲルに粒子性のごみが入っていても同じようなことが起こります。ごみはアクリルアミド溶液やバッファーに入っていることもありますし（シークエンス用のスラブゲルを作るときに良くやるように、APS, TEMEDを加える前にフィルターを通すと良い）、器具（ビーカーやガラス板など）がホコリで汚れている可能性もあります。

ウエスタンブロット、SDS-PAGEについて・・ 削除/引用 No.1049-1 - 2009/08/14 (金) 13:11:38 - western 今、ウエスタンブロットによって、タンパクを検出する実験をしている。 westernです。 いつも、何かにつけては失敗しており、今回は、原因がわからないので投稿しました。 この前、現像した際、サンプルのほうになぜか、レーンに沿って、黒い縦線が出てしまいました。 他の人に聞くと、「不純物が入っている」「ゲルがかたまっていない」「試薬がよく混ざっていない」といわれました。 しかし、不純物が入る理由もないし、ゲルは成功したときの時間配分で作り、試薬も、成功したときのものを使っています。 　 このほかに考えられる理由、それについての改善点はないでしょうか??? よろしくお願いします。

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