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(無題) 削除/引用 No.1048-6 - 2009/08/19 (水) 21:51:32 - orz >10kを超えるような長いベクターだと、全く入りません。 メーカーは10kb以上は効率が悪くなるので推奨できないと言っています 普通のクローニングで菌株を変えたりライゲーションキットその他を 見直したほうがいいとのことです >また、ウイルスベクターなどLTRの繰り返し配列があると、そこで組み変わってしまうようなのですが。 これはどこで組み変わるんですか？大腸菌内で？ それともIn-Fusionキットの酵素処理中の過程でですか？

(無題) 削除/引用 No.1048-5 - 2009/08/19 (水) 21:15:48 - 便乗 InFusion前のPCRで非特異のバンドが低分子側に出る場合はどうしますか？ さらにAneelの温度を上げたりして微調節します？ それとも気にせずに目的のバンドをゲル精製してそれを使いますか？ 温度や条件ふっても非特異が出るので目的産物をゲルから切り出し、 それをもとにさらにPCRをしてみたりもしたですが 末端に15bp余分なものがついているからか、増えたり増えなかったりで なかなか増幅が不安定で悩んでいます。 皆さんばしっとバンドは1本なのが普通ですか？ ところでライゲーションをしてもいいなら、ケミカルコンピを使わなくていいってことですよね

(無題) 削除/引用 No.1048-4 - 2009/08/17 (月) 21:07:23 - まうす 歩兵　様 In-Fusionでさらにligationのprotocolはないと思います。私が考えただけですから。 大腸菌の内部でニックは修復されると思いますが、ニック部分の末端は不安定でフラフラしているので、間違って他の部位へ挿入される場合があると考えています。事実、In-Fusionでコンストラクトをつくると、壊れたplasmidが多数得られます。場合によっては7/8が壊れていて、一個だけうまく行ったものが取れたりしました。但し、この場合は、plasmidに３つのPCRフラグメントをシームレスに繋げました。Sequenceすると、annealing部位が他の部位へ挿入した産物でした。普通のコンストラクションにIn-Fusionを使っていませんので、その場合どうなるかはわかりません。 普通の制限酵素-ligationでも、SAP処理をすると壊れたプラスミドが得られることが多いので（これも物によりけり）、ニック入りのplasmidは大腸菌内部では、ニックがないものと比較して不安定であると考えています（根拠となる論文等はなく、自分の感触です）。 次、InFusionを使って複雑なコンストラクトをつくるときに、ligationのありなしを試してみようと考えています。

(無題) 削除/引用 No.1048-3 - 2009/08/17 (月) 16:39:45 - 歩兵 まうす様、 In-Fusionの産物をin vitroでライゲーションするというプロトコルがあるのですか？ In-Fusion自体はエクソヌクレアーゼで、露出したssDNA部分でアニーリングした産物を大腸菌に導入すると、残ったssDNA部分が大腸菌の複製系の働きで修復されライゲーションされるのだと思っていたのですが。

In-Fusion Advantage PCR kit 削除/引用 No.1048-2 - 2009/08/17 (月) 13:56:57 - まうす In-Fusion Advantage PCR kitを使っていますが、制限酵素-Ligationの代わりになるほど効率が良いとは思えません。In-Fusionの説明書にもLigationよりは効率が悪いと記載されています。むしろ、制限酵素-Ligationではつくることが出来ないDNA constructの作製に使用しています。例えば、２−４つのフラグメントをシームレスに繋ぎたいとか、複数のpoint mutationを同時に入れるとかです。そもそも、かなり高価なキットなので、ルーチンに使うような代物ではないと思うのですが、、、。 このキットの使用のコツとしては、Annealingを50℃ 15minのあと、on iceにするより、thermal cyclerを用いて、60℃から温度を徐々に下げるとうまく行くようになったケースもあります。この辺りはAnnealingする配列によると思います。 また、In-Fusionで繋がったフラグメント同士には、ニックが出来ていますので、大腸菌のなかで組換えが起こる確率は高いです。これも時と場合によると思いますが、In-Fusion反応後ligationしておけば、ある程度組換えは防げると思います。私はやったことはありませんので、自己責任でお願いします。

In fusion advantage PCR 削除/引用 No.1048-1 - 2009/08/14 (金) 03:20:55 - qwerty In fusion advantage PCRをルーチンに使っても大丈夫だと思いますか？（制限酵素ーライゲーションをやめて） 数キロくらいまでの短いベクターだと高い頻度で入るのですが、10kを超えるような長いベクターだと、全く入りません。 また、ウイルスベクターなどLTRの繰り返し配列があると、そこで組み変わってしまうようなのですが。 こつがあるんでしょうか？

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