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(無題) 削除/引用 No.1042-7 - 2009/08/17 (月) 07:50:44 - グー Flow cytometryは慣れていても、マシンがかわると使いこなせないとか、かなり特殊な面があると思います。 質問はある表面抗原のあるなしの検出のようですので、系が部屋にあればそれほどは難しくはならないですが、それでもたいへんですね。 要は、コントロールをきちんと取り、この場合は陽性細胞の増減を見るのがふつうでしょう。コントロールが重要で、表面抗原の別のポジティブコントロールが必要かもしれません。よって１次抗体は最低２種、両方に使える標識２次抗体との組み合わせで、完全なコントロール（添加プラスマイナス、6種類？）を取ります。 うまくいっていない印象なら、よくあることですが、該当抗体が悪いというのがあります。

(無題) 削除/引用 No.1042-6 - 2009/08/16 (日) 06:50:34 - uu おっしゃっておられるように、一般的には特定集団の割合（陽性or陰性）の変化、ヒストグラムのピークの変化あるいはmean fluorescence intensityでしょう。複数回のサンプルがあるのであれば、各群のコントロールとのMFIの差の平均を比較されてもよいかもしれません。 FSC/SSCで細胞のsizeやgranularityが変わったというのも刺激が入ってるかを見る大事な所見とは思いますが、表面蛋白等の発現と関連があるか言い難いでしょう。 細胞の処理方法（固定の有無、抗体濃度、処理時間など）はすべて結果に影響してきますので、すべての実験で共通にする必要があります。いずれも陽性細胞やヒストグラムには影響するとは思いますが、FSC/SSCには影響しないのではないでしょうか？PMAやIonomycin、CD3/CD28刺激等はリンパ球のFSC/SSCには影響し、ゲーティングを変える必要はありますが。 解析にはFlowJoを使われてると思いますが、サンプル毎の細胞数が異なっていても、ヒストグラムの比較ができます。

(無題) 削除/引用 No.1042-5 - 2009/08/16 (日) 01:30:58 - FACS+初心者 ami さん、DCさん、月詠さん ご回答まことにありがとうございます。 後から、私の質問内容を読み返していましたが、かなり分かりにくい内容になってしまっていますね。すいませんでした。 私の質問の意図としては、 質問に示すようなデータ（使用できるかどうか？または、どのように分析すべきか？でしたので、分析方法や測定方法を改めて検討したいと思います。 もう一つの質問としては、発現細胞数のみの変化（ヒストグラム頂点の上下）や細胞形態の変化が生じた場合、このようなことは細胞の処理方法（固定の有無、抗体濃度、処理時間など）が影響してくるか？または、それはどの行程が一番影響するか？でしたが、 こちらもそれほど具体的には記述できないので、ご回答は得られないものとして、諦めようと思います。 ちなみに、細胞の処理方法に関しては、全く同じではありませんが、同系の細胞と同じタンパクをFACSにて検出した論文を参考におこないました。

それを聞いてどうしようというのでしょうか・・・。 削除/引用 No.1042-4 - 2009/08/14 (金) 12:05:52 - 月詠 「似たような結果しか得られない」というのは、どういう意味でしょうか？ 「（陽性であるはずの）ある細胞において陰性対照群（コントロール抗体処理群）と同じ程度の蛍光強度しか得られなかった」あるいは、「何らかの刺激を行った前と後でインテグリンの細胞表面上の発現に差がないという結果が得られた」が、その結果は、他の文献で提出されている結果と一致しない（つまり「再現性が得られない」）、ということでしょうか？ そういうことであれば、それは （１）「他の多くの類似例と同じようになるはずだ」というあなたの作業仮説（あるいは思い込み）が誤っている か （２）手技上のエラー（結果の判定法も含めて）によって誤った結果が得られている か、どちらかしか考えられません。 同じようにやったはずなのに同じ結果が再現されない、というこの手の問題は科学者の実務上、日常茶飯に生じえる問題です。しかし、異なる結果が得られた以上、どこかが違っていたのは間違いありません。そして、その異なる結果を導いた原因がどこにあったのかを判断することは、科学者としての資質を問われる重要な問題でもあります。 残念ながら、あなたの記述には手技に問題があったのか否かを判断する情報がまったく含まれていないため、この結果が、単なる技術上のエラーなのか、新しい発見なのかを判断することはできません。 ちなみにフローサイトメーターの解析においては、蛍光強度を示す軸は対数で表示されています。つまり単純にいえば、山が大きい目盛１つ分左右に移動したということは、蛍光強度が１０倍変動したことを意味します。ですから、もし発現レベルが２倍以内程度しかないというのが真実であれば、山はそれほど移動しないでしょう。その場合は、（一般的とはいえませんが）軸表示をリニアに切り替えてみたり、陽性画分の平均蛍光強度(mean intensity)で評価されてみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1042-3 - 2009/08/13 (木) 14:21:23 - DC 仰っている意味がいまいちわからないのですが、 ある環境下やある刺激下において、細胞のポピュレーションが変化している、という解釈に使えるか、という事でいいのでしょうか。 例えば、ある細胞集団は目的表面抗原XがHighとLowの２ポピュレーション存在するが、あるサイトカイン刺激によってHighとLowの割合が変化している というような・・・ このような解釈にはFACSは使えると思います。というかむしろ、このような使い方がメジャーではないかと思います。 しかし、「ヒストグラムでのピークが上がった・下がった」というのは少し難しいかと。FACSで取り込む細胞数を同じにしなければ、ヒストグラムのピークは当然変わってきますので。しかも、ここで仮に1万個取り込んだからヒストグラムで比較できるか、というと、取り込んだ細胞集団をFSC/SSCでゲートをさらにくくったりしていれば、このゲートに入る細胞数をきっちり揃えなければ比較できません。もし比較するのであれば、ヒストグラムなら「M1」中の％、ドットプロットであれば各領域での％を比較するのがいいのではないでしょうか。 お答えになっていないかもしれませんが・・・

(無題) 削除/引用 No.1042-2 - 2009/08/13 (木) 10:47:06 - ami 「 一般的なデータが得られていれば、問題がないのですが、条件を変えて何度おこなっても似たような結果しか得られず、困っています。 一般的なデータが得られない場合は、抗体濃度や処理法（固定の有無）の原因でしょうか？それとも、目的タンパクの発現パターンが影響しているのでしょうか？ 」 この辺は何を言っているのかさっぱりわかりませんが、 「 具体的には、陰性の細胞数が増えたとか、陽性細胞の数が減った（ヒストグラムでの山のピークの位置が上下に変化した）とか、細胞の大きさや性状（FSCやSSCの違い）が生じたとか… 」 という示し方はあります。ただ、FSC/SSCが変わったということは、細胞の大きさとかが変わったということで、目的の分子の発現が変わったと言うこととは意味がけっこう違うかと、、

FACSデータの解析・解釈について 削除/引用 No.1042-1 - 2009/08/13 (木) 10:30:16 - FACS 初心者 いつも参考にさせていただいています。 いくつかの細胞を使用して、FACSをおこなっています。 通常、いくつかの論文を読んでも、ほとんどのFACSによるデータはFL-1/Cell countのヒストグラムが右方か左方に移動したとか、ドットブロットで陽性集団が移動したとかで発現の違いを示していますが、他の表現方法はあるのでしょうか？ 具体的には、陰性の細胞数が増えたとか、陽性細胞の数が減った（ヒストグラムでの山のピークの位置が上下に変化した）とか、細胞の大きさや性状（FSCやSSCの違い）が生じたとか… 一般的なデータが得られていれば、問題がないのですが、条件を変えて何度おこなっても似たような結果しか得られず、困っています。 一般的なデータが得られない場合は、抗体濃度や処理法（固定の有無）の原因でしょうか？それとも、目的タンパクの発現パターンが影響しているのでしょうか？ ちなみに、今目的としているものは、インテグリンなどの細胞表面に存在する接着分子です。 経験豊富な皆様にご回答をいただき、参考にしたいと思いますので、よろしくお願いします。

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