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(無題) 削除/引用 No.1036-13 - 2009/08/13 (木) 03:31:52 - Tb > >これもどですかね。浸透圧ならPEGの分子量が小さい方が良いことになってしまいますよ。 > > 考えてみたけれど、これもこう言う理屈がわかりません。 浸透圧はモル数に比例するという法則（π = MRT）から、同じ重量濃度で使うなら、低分子PEGの方がモル数が多くなるから浸透圧も高くなる、という理屈をいっているのだと思いますが、実はタンパクなどの高分子にはこのvan't Hoffの式は当てはまりません。分子内揺らぎも浸透圧に影響するからです。学部学生の物理化学かなんかの授業で、PEGは各ユニットがくるくる自由に回るモデル分子として高分子による浸透圧を教えるときに引き合いに出させれていたのを思い出しました。じゃあ、同じ重量濃度の時にPEGの分子量と浸透圧の関係はどういう曲線になるのかといわれるとおぼえていませんが・・・

使いますが・・・ 削除/引用 No.1036-12 - 2009/08/13 (木) 01:17:43 - K PEGで濃縮する方法は使いますが、教授のおっしゃったように 「ちょっと乱暴だけど」という感覚で使いますね。 トータルの蛋白量が多いのであれば、まあいいかなというところでしょうか。私の場合回収率は落ちたし（手技によるでしょうけれど）、良し悪しかなという感想です。 別にアミコンを「使わねばならない」わけじゃないですよ。 むしろ「使わねばならない」とマニュアルのように思ってしまうことのほうが問題じゃないかなあと思います。ささいなことでも、こういう手法の原理を頭にいれて、それを応用することが大事なんじゃないかな、と思います。 蛋白質の活性を維持するかどうかに関わりますが、いろんな濃縮法あると思いますよ（と、婉曲に）。

(無題) 削除/引用 No.1036-11 - 2009/08/12 (水) 22:17:22 - AP >これもどですかね。浸透圧ならPEGの分子量が小さい方が良いことになってしまいますよ。 考えてみたけれど、これもこう言う理屈がわかりません。

(無題) 削除/引用 No.1036-10 - 2009/08/12 (水) 22:05:11 - AP >> 限外濾過と透析は、そのモータルフォースを遠心による重力や吸引によって得るか、内外濃度差で生じる浸透圧によって得るかが違うだけ。 これは間違いです。 >限外濾過と透析は全くの別物でしょ。透析膜に穴なんてありません。 そんなばかな。穴がなかったら水も低分子も通らないでしょう。透析膜にもポアサイズが異なるものがあり、それによって分画分子量もちがいます。 ttp://jp.spectrapor.com/dialysis/rc.html ttp://www.ieda-boeki.co.jp/main/products/products1-01/02/01.html

(無題) 削除/引用 No.1036-9 - 2009/08/12 (水) 21:46:51 - AB-1100 >[Re:8] 月詠さんは書きました : > 限外濾過と透析は、そのモータルフォースを遠心による重力や吸引によって得るか、内外濃度差で生じる浸透圧によって得るかが違うだけ。 これは間違いです。 限外濾過と透析は全くの別物でしょ。透析膜に穴なんてありません。 >[Re:1] やっぱ教授には敵わないなあ。。さんは書きました : > これはおそらく浸透圧を利用した脱水法だと思うのですが、 これもどですかね。浸透圧ならPEGの分子量が小さい方が良いことになってしまいますよ。

これって要するに・・・ 削除/引用 No.1036-8 - 2009/08/12 (水) 21:34:16 - 月詠 これって要するに原理は同じですよね。 限外濾過も透析も、（素材の違いはともかく）ある分子量以下の分子だけを通す膜を通過させることによって混入した小分子を分離させるわけですから。 限外濾過と透析は、そのモータルフォースを遠心による重力や吸引によって得るか、内外濃度差で生じる浸透圧によって得るかが違うだけ。 透析膜の孔が８Ｋより大きくて、外部のＰＥＧ８０００が内部に浸透してしまうと台無しですので、透析膜の孔サイズやＰＥＧの分子量を間違わないように注意することです。硫案は透析膜を抜けて内部に逆浸透してしまうのでマズいですよね。 それから、ＰＥＧを使い回した場合、前回ＰＥＧに吸湿させたバッファー分子（ＴｒｉｓやＨＥＰＥＳなど）や混入していた何らかの小分子が、新しい試料に逆浸透して混入してしまう可能性がありますので、基本的に再使用はなさらない方がよいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1036-7 - 2009/08/12 (水) 20:30:47 - A > バッファーの組成は変わらないでしょ？ おおさんが以前書いておられるように微量の小さなPEGが入り込む 可能性がないわけではありませんが、PEGは分子量が大きいから 基本的には透析膜を通過できないはずですね。以前硫安で濃縮して 蛋白質が変性してしまい諦めたことがあったのですがPEGでやり 直してみる価値ありそうです。 > PEGの費用だって安いもんだし。 なんとなくPEGはそんなに安くなかった印象があったのですが私の 勘違いですか。

こんなすばらしい方法があったとは 削除/引用 No.1036-6 - 2009/08/12 (水) 19:09:46 - ~ と思ったら、 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=2760 おおさんが過去に書いていましたね。 硫安だと溶けた後に半透膜の中に入るでしょうけれども、 PEGの場合、大き目の分子量のものを使えば中に入らないのがメリットですね。 分子生物学グレードのPEG6000であれば、半透膜は通らないサイズだと思います。 Wakoの定価で1kg7900円だったので、1回に使うのは数百円くらいでしょうか。 アミコンは1本2千円くらいしますので、大容量の濃縮であればよさそうですね。 ただ、PEGを使いまわすのは私にはちょっと気持ち悪くて出来ません。

(無題) 削除/引用 No.1036-5 - 2009/08/12 (水) 18:13:03 - みずぶとりくん バッファーの組成は変わらないでしょ？ PEGの費用だって安いもんだし。

(無題) 削除/引用 No.1036-4 - 2009/08/12 (水) 17:04:54 - A PEGではありませんが硫安で以前PNEに載った記事と基本的に同じ方法 なので結構知られていると思います。サンプル濃度が硫安沈殿に使用 できるほど濃くない場合に使う方法です。以下のリンクの実験的 プロトコール（その２）の部分です。 http://www.ims.u-tokyo.ac.jp/ohmiken/Lab%E3%83%A1%E3%83%A2/memo12.html このような方法を使わないのは １．組成が急激に変わって蛋白質が変性してしまう可能性が高い（山田さんの指摘の通り） ２．費用が高くなる（サンプルの体積によりますが） からでしょう。アミコンならば蛋白質濃度以外の組成は基本的に変わら ないと予想されますから。 >ちなみにPEGで脱水後、すぐにPBSにbuffer置換（透析）したので目的の >タンパクは大丈夫でした。 私は硫安でやったことがありますがこの最後の透析ステップで体積が結構 増えてしまってあまり濃縮効果が得られなかったことがあります。

(無題) 削除/引用 No.1036-3 - 2009/08/12 (水) 16:38:20 - やっぱ教授には敵わないなあ。。 山田さん 返信ありがとうございます。 >バッファー組成変わってるし。 えっと、精製した直後のbufferはTris-HCl, NaCl, クエン酸から構成されるpH7.4のbufferになってるはずです。 これをPEGで濃縮する際に、水だけしか移動しないんですかね？ アルブミンによる膠質浸透圧の原理と同じなんでしょうか、、、 ちなみにPEGで脱水後、すぐにPBSにbuffer置換（透析）したので目的のタンパクは大丈夫でした。

(無題) 削除/引用 No.1036-2 - 2009/08/12 (水) 15:45:35 - 山田 よ〜くかんがえよ〜 教授は「ちょっと乱暴だけど」っていってるやん。 バッファー組成変わってるし。

今まで知らなかったタンパク濃縮法 削除/引用 No.1036-1 - 2009/08/12 (水) 15:12:59 - やっぱ教授には敵わないなあ。。 先日、タンパクを精製したところかなり薄い濃度になってしまいました。 0.1 ug/ul以下で、希望としては5 ug/ulくらいにはしたかったんです。 このタンパクは分子量で150 kDa程度ですので0.1 ug/ulの5 ml全てをアミコンのチューブで濃縮しようと考えていました。 ところが、教授にそういうと「ちょっと乱暴だけどポリエチレングリコールで濃縮すればいいじゃんか」と言われました。 やり方は、透析膜に5 mlを入れ、封をします。 それを金属のプレートに乗せて、そこへ分子量8000程度のPEG 粉末をぱらぱらと上から振りかけ、 まるで卵に浸したエビにパン粉を付けるかのように。 すると、驚いた事に5 mlあった精製タンパク溶液はあっという間に1 ml程度までになりました。 もちろん透析膜の上を被っているPEGはびしょびしょに濡れています。 なるほど、こういうやり方があるのかと、自分はまだまだ知らない事が多いなあと思いました。 これはおそらく浸透圧を利用した脱水法だと思うのですが、ではなぜこのような簡便な方法があるというのに、わざわざ高いお金を出してアミコンウルトラや限外ろかなどをしなければならないのでしょうか？（もちろん濃縮したいタンパクの分子量に依存すると言われればそれまでですが。） みなさんはこういったPEGを使用した濃縮法はご存知でしたか？ 私はすごく感動しました。逆にこの濃縮法の欠点はわかりません。 みなさんなら例えば150 kDaのタンパクを濃縮する場合、このようなやり方をしようしたいと思いますか？ またびしょびしょにぬれたPEGを乾燥させれば再び、別のタンパクの濃縮なんかにも使えるのかなと考えるとますます、経済的な濃縮法だなあと思ってしまい脱帽です。 みなさんのふと感じた感想など聞かせていただけると嬉しいです。

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