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(無題) 削除/引用 No.1032-16 - 2009/08/19 (水) 18:16:57 - C 糖かリン酸を考えているなら染色でとりあえず確認してみては。 stains allで同じ色に染まるか、 リン酸基をそめるメチルグリーン、 糖ならアルシアンブルー、パス染色。 ゲルを染めるプロトコルもあったと思います。 断定はできないけれど、MSやるつもりなんだったらその目安くらいにはなると思います。 酵素あるならきっちゃってもいいかなとも思いますが。 メチルグリーン染色は面倒臭いので酵素の方が楽かもしれませんね。 糖とかだとうまく切れないのもありますよね。そういうのはMSも大変そうですけど。

(無題) 削除/引用 No.1032-15 - 2009/08/13 (木) 19:15:43 - A 以前見かけただけで実際には使ったことがありませんが糖鎖修飾を 検出するキットがメジャーなメーカーから出ていたはずです。全て の糖鎖修飾を検出できたか、どらぐらい信頼が置けるのか覚えて いませんがアプローチの候補として検討してみる価値はあるかも しれません。

(無題) 削除/引用 No.1032-14 - 2009/08/13 (木) 06:09:57 - おお >[Re:13] ねうろんさんは書きました : > 50から80ではなく > 80から50というのはないですかね？ > > つまりオリジナルは80kDaで普段は速やかにプロセシングを受けているが強制発現下のある条件下ではそれが抑制されていると。 面白いアイデアだとおもいます。その先もちょっと考慮に入れるか 考えてみたいと思います。併し乍ら、アミノ酸の数から考えて 80kDaは大きすぎますので、自然と修飾という感じに考えが いってます。 ただ強制発現でも、条件次第なんです、、、、

(無題) 削除/引用 No.1032-13 - 2009/08/13 (木) 05:06:56 - ねうろん 50から80ではなく 80から50というのはないですかね？ つまりオリジナルは80kDaで普段は速やかにプロセシングを受けているが強制発現下のある条件下ではそれが抑制されていると。

(無題) 削除/引用 No.1032-12 - 2009/08/13 (木) 04:51:08 - おお >[Re:11] 名無しさんは書きました : > > 強制発現の結果は確かに十分な注意が必要ですし、しないで済むならそれにこした事はないですが、内在性レベルでは量的に少なくて検出出来なかった修飾体などが、強制発現することで基質蛋白質じたいの量が増えてうまく検出できるレベルに達したという可能性もあると思うので、現段階ではこれはこれで大事にした方がいいと思います。 >[Re:9] うさんは書きました : > ＞今扱っているたんぱく質は通常50kDaぐらいに出てくるのですが、 > > 通常というのは、内在性に発現したものであるのか？ > もしそうなら、内在性のものでも、80kDaのものが検出されるのか？ > （ある条件下にしてみたときとか） プラスミドがら発現したものが、2つのバンドを与えます。 のでプラスミド自身がおかしいというのは否定的と考えてます。 > > ＞cDNAを強制的に発現させた系で、ある条件下で80kDaくらいに > バンドが出てきます。 > > 強制発現はあくまで強制発現、過剰に発現しているときには何が起こっているか、 >[Re:6] rさんは書きました : > 過剰発現によるアーティファクト。 > 確かに強制発現に関して、注意しないといけないと思っております。 ただ私は名無しさんの指摘と同じようなことを考えています。 加えて、同じような高分子へのシフトが組織のライセートで認められていますので、何か生理的な条件下でも修飾する系があるのだろうと考えています。 ある条件と書きましたが、下にも書いてますが、高分子側への シフトはある程度いろいろな観点からありそうだという感触は あります。 ユビキチンは今のところネガティブです。ただほかのグループがその可能性を 示していますが、その実験系ではラダーや高分子がわでスメアーがみられていますが、私の系ではそういう典型的なパターンは見られていません。80と50の間にもしかしたら中間体(60kDa)くらいかな、、、がそんざいしている可能性がありますが、80kDaとの関係がいまのところ分かっていません。

(無題) 削除/引用 No.1032-11 - 2009/08/13 (木) 04:13:20 - 名無し 修飾に関してはクマシーでこのバンドと分かるくらいあるならば、LC-MS/MSをどっかに頼んで調べてもらえば何か情報が得られるだろうと思います。糖鎖が疑われるならendoFとかで処理してみて分子量に変化があるか見てみればわかるのではないでしょうか。糖鎖だとバンドがシャープでなくてボーッとした感じとか銀染で色調が少し違うとかあるかもしれません。強制発現だとユビキチン化されたものという可能性もあるかもしれないですが、WBとかしたとき、より高分子量の方はどんな感じかみてみるとかもいいかも。修飾についてはバンドの見かけの形は何かヒントになるかもしれないと思います。 シャペロンみたいな性質をもつような30KDaくらいの細胞内蛋白質の何かと強固に結合して極めて安定なコンプレックスを形成しているということも否定できません。ただ生理的にありうる何か意味のあるものかあくまで強制発現に伴うものかは分かりませんが。 強制発現の結果は確かに十分な注意が必要ですし、しないで済むならそれにこした事はないですが、内在性レベルでは量的に少なくて検出出来なかった修飾体などが、強制発現することで基質蛋白質じたいの量が増えてうまく検出できるレベルに達したという可能性もあると思うので、現段階ではこれはこれで大事にした方がいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1032-10 - 2009/08/13 (木) 03:11:26 - おお >[Re:7] あべちゃんさんは書きました : > でも、結局、MSに行き着いてしまいます。 > いきなり、MSでもいいかとおもいます。 この時の結果とそれに対する結論の持って行き方 についてのフローがなんとなく思いつかないのですが、、、 燐酸かとかアセチル化とかなら、得られたペプチドや それからのコンポーネントのマスからある程度検討つきそうですが、、 シュガーとかどうでしょうか、、、、

(無題) 削除/引用 No.1032-9 - 2009/08/12 (水) 13:59:38 - う ＞今扱っているたんぱく質は通常50kDaぐらいに出てくるのですが、 通常というのは、内在性に発現したものであるのか？ もしそうなら、内在性のものでも、80kDaのものが検出されるのか？ （ある条件下にしてみたときとか） ＞cDNAを強制的に発現させた系で、ある条件下で80kDaくらいに バンドが出てきます。 強制発現はあくまで強制発現、過剰に発現しているときには何が起こっているか、 生体内でのことを再現しているのか、わからないと思います。 そのことを吹っ飛ばして考えていい理由があるならMSでもなんでもやっていいと思いますが、 部下がいきなりMSやりたいといっても、 その前にその強制発現系とやらがちゃんとしたものなのか私だったら聞くと思います。

(無題) 削除/引用 No.1032-8 - 2009/08/12 (水) 13:04:55 - ザンギ 真核生物の発現系ですよね？ 何かのシグナル配列がついてるんなら、糖鎖修飾かも。 とりあえずConAレクチンとかでブロッティングしてみるかな。 ２本出るバンドの間で染色性が違えば糖鎖かも。

(無題) 削除/引用 No.1032-7 - 2009/08/12 (水) 12:39:43 - あべちゃん >[Re:1] おおさんは書きました : > 今扱っているたんぱく質は通常50kDaぐらいに出てくるのですが、 > cDNAを強制的に発現させた系で、ある条件下で80kDaくらいに > バンドが出てきます。 Deletion Seriesをいくつか作ってみて、どこに修飾される残基があるのかを見積もる。 絞り込めたら、その周辺に、既知コンセンサスは無いか調べる。 でも、結局、MSに行き着いてしまいます。 いきなり、MSでもいいかとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.1032-6 - 2009/08/12 (水) 12:15:28 - r 過剰発現によるアーティファクト。

(無題) 削除/引用 No.1032-5 - 2009/08/12 (水) 08:56:49 - おお >[Re:2] rさんは書きました : > コンストラクトが間違っている可能性の追求。 それは大丈夫だと思います、正常な位置にもバンドが出ますから。

(無題) 削除/引用 No.1032-4 - 2009/08/12 (水) 08:55:42 - おお >[Re:3] グーさんは書きました : > hRad9とかは、とんでもなくリン酸化でシフトしたと思います。脱リン酸化酵素でシフトを検討してから、MSというのはどうでしょう。 yperphpsphorylation で大きくシフトするタンパクがありますね。そういうのって ラダーになったりスメアーになったりします。 確かに一つの燐酸かで大きく移動度が変わるケースもあるかもしれませんね。 脱燐酸かは移動度が変わればそうかと思えるのですが、変化しなかった時の 評価をどうするか、、、というのがちょっと気になりますね。 32Pラベルも考えないといけないかなぁ、、、、

(無題) 削除/引用 No.1032-3 - 2009/08/12 (水) 08:47:11 - グー hRad9とかは、とんでもなくリン酸化でシフトしたと思います。脱リン酸化酵素でシフトを検討してから、MSというのはどうでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1032-2 - 2009/08/12 (水) 08:20:24 - r コンストラクトが間違っている可能性の追求。

たんぱく質修飾の可能性 削除/引用 No.1032-1 - 2009/08/12 (水) 01:23:59 - おお 今扱っているたんぱく質は通常50kDaぐらいに出てくるのですが、 cDNAを強制的に発現させた系で、ある条件下で80kDaくらいに バンドが出てきます。 でたんぱく質が修飾されていることを考えているのですが、 みなさんならどのようなアプローチをとりますか? いきなりMSというのは、修飾がなにか検討がついてないと 難しいかもしれないという気がしています。

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