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(無題) 削除/引用 No.1030-17 - 2009/08/13 (木) 09:00:48 - 通りがかり > AとBの間に制限酵素が入ってもin frameであれば問題ないんですか？ ケースバイケースです。 > その場合は、アミノ酸何個までならOKとか決まってますか? 決まってません。ケースバイケースです。 > そういう細かいコンストラクトの作り方は論文のMethodsに記載しなくてもいいんでしょうか？ 記載する場合もあればしない場合もあります。ケースバイケースです。 真っ当な研究室なら、直接問い合わせれば配列を教えてくれるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1030-16 - 2009/08/13 (木) 04:37:33 - 苦労人 偶然私もコドンの事で悩んでいたので、便乗で質問させてください。 motif Aとmotif Bのfusion proteinのコンストラクトを使りたいのですが、 同じコンストラクトを使っている論文のmethodsを見ても細かいコンストラクトの作り方を書いてませんでした。 論文のmethodsはThe DNA fragment was fused in frame cDNA encoding motif B(aa400-450).という説明一行で終わっていました。 motif Aとmotif BはともにPCRで増やしたいのですが、ATG-motifA-motifBというコンストラクトを作りたい場合に、AとBの間に制限酵素が入ってもin frameであれば問題ないんですか？ その場合は、アミノ酸何個までならOKとか決まってますか? そういう細かいコンストラクトの作り方は論文のMethodsに記載しなくてもいいんでしょうか？ アドバイスお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1030-15 - 2009/08/12 (水) 12:52:51 - 千夏 >[Re:11] TK-1さんは書きました : > 細かいことですが、in frameとinflameは全く別の意味です。 はっはっはｗ　そんなミスするわ・・・け・・・が・・・・・

(無題) 削除/引用 No.1030-14 - 2009/08/12 (水) 12:30:43 - ？？？ >[Re:11] TK-1さんは書きました : > 細かいことですが、in frameとinflameは全く別の意味です。 ぎゃーーー、お恥ずかしい、、、 何度もエラそうに使ってしまいましたーーー

(無題) 削除/引用 No.1030-13 - 2009/08/12 (水) 12:29:45 - 千夏 追記しておくと、 ・ちゃんとstop codonは構築用のprimerでぬいておくこと！！ ・stop codonの3個の塩基配列の前の3個の塩基配列を1セットとして、GFPがinframeかどうかを確認すること！！

(無題) 削除/引用 No.1030-12 - 2009/08/12 (水) 12:25:27 - 千夏 よ〜〜くよ〜〜〜〜〜く初めの質問を見ると、 >開始コドン（ATG）のひとつ前のコドンなのでアミノ酸にはならないので ってあるじゃないですかっ！！(>_<) でも勘違いしてると思われるところを解説してみると、 タンパク質の翻訳は「ATG」から始まります。つまりinframeの確認をするときの初めの3つは「ATG」です。さらに言えば、翻訳開始のATGの前がAでもGでもCでもTでも、それが何個あろうともinframeの確認はATGからです！ここが一番あいにゃんさんが混乱しているところだと思うので2回いっときました。 例）GAATTC-ATG(目的タンパク質の翻訳開始部位)-GTGTACATC・・・ で、翻訳されてできてくるアミノ酸配列は、 Met-Val-Tyr-Ile・・・ 2塩基いれて GAATTC-GG-ATG(目的タンパク質の翻訳開始部位)-GTGTACATC・・・ で、翻訳されてできてくるアミノ酸配列は、 Met-Val-Tyr-Ile・・・ 同じでしょ？？ LeuもProも何も翻訳されてきません！ でもいっぱいATGあるわけで、じゃぁどっから？ってなったとき、どうやら多くの場合、kozak配列をもつATGから翻訳が始まるみたいです。 ここを見るとわかりやすいです。 http://ja.wikipedia.org/wiki/%E3%82%B3%E3%82%B6%E3%83%83%E3%82%AF%E9%85%8D%E5%88%97 読むのが面倒なら、 AAA(お守り)-(制限酵素配列)-GCCACC(kozak配列)-ATG・・・（目的遺伝子配列) GCCACCを翻訳開始ATGの前にいれたprimer（例：AAA-GAATTC-GCCACC-ATGXXXXXXXXXXX)を設計してPCRをして再構築すればいいです。今の発現ベクターは最悪発現しない可能性を考慮しておいたほうがいいです（kozak配列なくても発現はしますが・・）。

http:// 削除/引用 No.1030-11 - 2009/08/12 (水) 12:18:31 - TK-1 細かいことですが、in frameとinflameは全く別の意味です。

(無題) 削除/引用 No.1030-10 - 2009/08/12 (水) 12:16:50 - R 目的遺伝子の開始コドン前の配列で気にするのは、？？？さんの仰るとおりコザック配列かどうか。 インフレームかどうかは目的遺伝子のC末(もしくはGFPのN末)を考えるのではないでしょうか。 (目的遺伝子とGFPのフレームが合うかどうかで考えてみてください)

(無題) 削除/引用 No.1030-9 - 2009/08/12 (水) 12:02:51 - ？？？ わかったようなわからないような。多分まだわかっていません。 のでもう一つ確認させて下さい。 MCS-Cをひとまず無視して、単純にATGからだけ考えて下さい。 ATG-マウスホモログ-GFP ATG-ヒトホモログ-GFP においてATG以下のマウスホモログ、ヒトホモログ部分はそれぞれ当然3塩基ずつの読み枠は合っているのですよね？ そしてそのストップコドンを除いた領域がどうにかしてGFPの入ってたベクターに入っていると。 かつ、それぞれホモログ上流のATGから数えてGFPの領域の読み枠も合っていると。 これで宜しいのでしょうか？ それともマウスホモログはそれ自体、GFP共に読み枠は合っているが、ヒトホモログに関してはそれ自体は合っているが、GFP領域ではずれている、という事でしょうか？ というのも >>上手くGFPとinflame fusionになるようなんです。 というくだりがよくわからないのです。 もしその2塩基をいれないとinflameにならないというのであれば、>>あいにゃんさんは何か大きな勘違いをしていて、>>ザンギさんが仰る様に2塩基入れるべきはGFPの前になるはずです。 ATGの前に1塩基、2塩基入れようが、1塩基除こうが、ATG以降のinflameでないものがinflameになることは有りません。 私が言っているflame、又は読み枠はATGを基準に下流に向かっての言葉ですが、あいにゃんさんの使っている”flame”はどこを基準にどこに向かってでしょうか？

http:// 削除/引用 No.1030-7 - 2009/08/12 (水) 11:53:33 - TK-1 > その場合、フレームがうまく合わず、そのためヒトホモログのATGの前に２塩基を挿入すれば > > 　(MCS)-(GAATTC)-●○(任意の２塩基)-ATGヒトホモログ-GFP-(MCS)こうなり、上手くGFPとinflame fusionになるようなんです。 > > 私の説明ではどこかおかしいでしょうか？素人で大変申し訳ありません。 > どうぞ率直に問題点 等、ご指摘いただきたく、心よりお 願い申し上げます。 > あまりきつい言い方は失礼ですが、 翻訳されない領域に、コドンがどういう関係があるんですか。EcoRIのサイトはGlu-Pheに翻訳されるとでもおっしゃるのでしょうか？？？ATGの上流が翻訳されるのであれば、promoterやMCSすべてが翻訳されて大変なことになると思います。素人でという言い訳で、教科書を読むのをさぼるのはどうかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1030-6 - 2009/08/12 (水) 10:54:54 - あいにゃん ？？？様ありがとうございます。 私が分子生物学に素人なためとんちんかんな質問や返信をしてしまったようです。すみません。 ???様が仰る通り、 MCS-CATG-目的蛋白質-GFP-MCSです。 　(MCS)-(?制限酵素サイト)-ATGマウスホモログ-GFP-(MCS)が手元にあり、 これを次のように変換したいんです。 　(MCS)-(EcoR1制限酵素サイトGAATTC←このCです)-ATGヒトホモログ-GFP-(MCS) 私がコドン合わせをしなくてはならなくなった理由は ATGマウスホモログの全長がクローニングされたクローニングサイトとは別のMCS(EcoR1サイトです)にクローニングしたいためなんです。 その場合、フレームがうまく合わず、そのためヒトホモログのATGの前に２塩基を挿入すれば 　(MCS)-(GAATTC)-●○(任意の２塩基)-ATGヒトホモログ-GFP-(MCS)こうなり、上手くGFPとinflame fusionになるようなんです。 私の説明ではどこかおかしいでしょうか？素人で大変申し訳ありません。 どうぞ率直に問題点 等、ご指摘いただきたく、心よりお 願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.1030-5 - 2009/08/12 (水) 10:11:12 - おお 例えばCを削ったら何が来るんですか? とか考えるとあれがいいとかいう議論はどうもみのらない 努力のような気がします。しかもN末にGFPをつける時点で Mの一つ先のアミノ酸がとか言うのは、、、、、 慎重にするなら、いろいろアミノ酸をかえて適切なものを 選ぶということになると思いますし、そうでなければとにかくやってみる ぐらいの選択肢でしかない様なきもします。 しめしたなかで選べというなら、 １、ロイシン　 ２、プロリン のどちらかをえらぶでしょう。電荷があるよりはないもの、 あとはプロリンはなにか構造がその前までとっていたとして、 回転の自由度がないので、そこでブレイクが入るかもしれない と漠然と考えるからです。

(無題) 削除/引用 No.1030-4 - 2009/08/12 (水) 10:08:47 - ？？？ とすると何に対してコドン合わせをする必要があるとお考えでしょうか？ 言い換えると何に対してコドンがずれていると考えているのでしょうか？ あれ？俺が勘違いしてるのかな？？ MCS-CATG-目的蛋白質-GFP-MCS (MCSはマルチクローニングサイト) ですよね？ （それともMCS-ATGC-目的蛋白質-GFP-MCSですか？ それだとお答えになった文章と違う気がするけど。） とすると気にすべきはATGから始まってその後のGFPのコドンがきちんと合っているかで、ATGの前は関係ないはずですよ、読み枠とは。 但し、ATGの前に"Kozak sequence"を入れるか入れないかの問題は有りますが。。 （これに関しては他のスレッドで議論されているので、検索して下さい。）

(無題) 削除/引用 No.1030-3 - 2009/08/12 (水) 09:49:11 - あいにゃん ザンギ様　 ありがとうございます。 >どうもGFPのORFの前につなぐ配列にCが一個残るので、読み枠を合わせるために２塩基追加するということのようですが．．． GFPはinsertしたい遺伝子のお尻に付くようにしてありますので、違うんです。 insertしたい遺伝子のATGのひとつ前に(vector由来の制限酵素サイトの最後の塩基に)Cがあるんです。 >PCRプライマーを設計するときに、読み枠を合わせなかったってことでしょうか？２塩基だけ挿入なんて現実的にはとても大変 いいえ違います。 もともと別のspeciesのinsertが入ったvectorから、insertを切り出し、残ったvectorに別のspeciesのinsertを張り替えたいんです。 ですので、コドン合わせをする必要が出てきてしまったんです。 >>開始コドン（ATG）のひとつ前のコドンなのでアミノ酸にはならないので何も考えず任意の塩基の挿入を行えばよいのでしょうか？ >これは何か勘違いしてるのでしょうか？ATGはGFPのコドンで融合タンパク質を作りたいんですよね？ いいえ違います。 GFPは目的の遺伝子のお尻に付くようにしてありますので、insertのATGを開始コドンとして使用しなければなりません。 私の説明不足で申し訳ありません。 引き続き、ご教示いただけますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1030-2 - 2009/08/12 (水) 00:33:13 - ザンギ どうもGFPのORFの前につなぐ配列にCが一個残るので、読み枠を合わせるために ２塩基追加するということのようですが．．． どれも避けたい奴ばっかり（苦笑） Cを除いたDNA断片は作れないのでしょうか？ >諸事情で、コドン合わせをする必要性が出てきました。 これがよくわからないんですよね。 PCRプライマーを設計するときに、読み枠を合わせなかったってことでしょうか？ ２塩基だけ挿入なんて現実的にはとても大変ですから、プライマーを設計しな おすほうがいいと思うんですけど．．． 推測なので、まぁこの辺で。 >開始コドン（ATG）のひとつ前のコドンなのでアミノ酸にはならないので何も考えず任意の塩基の挿入を行えばよいのでしょうか？ これは何か勘違いしてるのでしょうか？ ATGはGFPのコドンで融合タンパク質を作りたいんですよね？

plasmid作成時のコドン合わせの疑問 削除/引用 No.1030-1 - 2009/08/11 (火) 21:51:49 - あいにゃん いつもとても参考にさせていただいております。 今回、私の実験で、興味ある遺伝子をGFP融合タンパクとして強制発現させるために、GFPの配列が組み込まれたプラスミドにクローニングしようとしています。 諸事情で、コドン合わせをする必要性が出てきました。 開始コドン（ATG）の前に、二つの任意（？）の塩基の挿入でinflame GFP fusionになるようです。 GFPは興味ある遺伝子のC末側に付きます。 こういった実験は初めてでして、とんちんかんな質問かもしれませんが、どうか経験豊富なみなさまのご意見を伺えないでしょうか？ 質問というのは、コドン合わせのために挿入した任意の２つの塩基から作られるアミノ酸は、 １、ロイシン　 ２、プロリン ３、ヒスチジン ４、グルタミン ５、アルギニン のいずれかでした。 そこで、みなさまにお聞きしたいのは、上記したアミノ酸のどれにすれば無難でしょうか？ 素人的には電荷がないアミノ酸だとか、分岐鎖の程度が小さいアミノ酸の方が影響ないのかなとも思います。。 こういった場合、こうした方がいいとかのコンセンサスなんかはあるのでしょうか？ 開始コドン（ATG）のひとつ前のコドンなのでアミノ酸にはならないので何も考えず任意の塩基の挿入を行えばよいのでしょうか？ どうかみなさまご教示いただけますと幸甚です。

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