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(無題) 削除/引用 No.102-6 - 2009/05/01 (金) 15:00:28 - でん 検出の方法もう少し詳しく教えてください。 2次抗体を使用していますか？ どのような二次抗体を使用しました？ IP時の非特異結合がそもそも問題のようですので まずはビーズへの非特異なのか確認したほうがよいかもしれません。 私も前に間違っていたのですがチューブに非特異的に結合したタンパクを そのまま溶出して回収していました。 溶出の前にチューブを新しいものに代えることで改善されました。 ウォッシュのバッファーは何を使っています？

(無題) 削除/引用 No.102-5 - 2009/02/26 (木) 17:24:53 - DNAI 以前ここで教えて頂いた、TrueBlot（ベイバイオサイエンス）はかなりお勧めです。 非変性の抗体のみ認識しますので、ビーズ由来の変性抗体はほとんど認識しません。ただし、検出時の露光時間を増やすと徐々にＨ鎖、Ｌ鎖が出現しますが…。感度の面でも申し分なく最近は愛用しています。

コメント有難うございます 削除/引用 No.102-4 - 2009/02/26 (木) 16:40:39 - IP なるほど、基本的なことが分かっていなくて恥ずかしい限りですが、丁寧に教えていただきどうも有り難うございました。早速、ProteinA-HRPを使って検出してみたいと思います。架橋するのはラボの別の人が試したのですが、あまり効率が良くなかったようでやってませんでしたが、標識ProteinAでもだめならもう一度試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.102-3 - 2009/02/26 (木) 15:59:48 - 名無し それは、WBのときに2次抗体がIPに用いた抗体（ビーズに共有結合させていないと溶出のときサンプルに混入する）と反応しているためと思います。またprotein AまたはGも一部外れる可能性もありえるのでそういうものもはいっているかもしれません。 （本来IgGはH鎖５０K　L鎖２５Kくらいですが、量が多いとそれ以外にも変なバンドがいっぱいでてスメアに見えます。） IPに用いた抗体：ウサギIgG、WBの一次抗体：ウサギIgG、WBの標識2次抗体：抗ウサギIgG抗体。というふうに考えれば分かると思います。 抗体をprotein A またはG　dynabeasに結合させたあとにDMPなどの架橋剤で共有結合させれば、溶出のときに試料に大量の抗体が混入するのを避けることができます。これは上記のような問題を解決するために非常に一般的に行われています。ただ100%結合させることはできないので、溶出のとき一部はずれるのでどうしても多少の抗体の混入はありますが、何もしないときよりは格段に少なくなります。ただ溶出のときbMEなどの還元剤入りのbufferを使うとL鎖が混入します（共有結合は主にH鎖のFc portionとprotein Aの間でできているからです。）ので、できればbMEなしのbufferで溶出してください。 2次抗体の代わりに標識protein A またはGを使うこともできます。これらは変性した状態のIgGとはあまり結合しないのでIPの抗体のバックグラウンドのシグナルはかなり減らせます。ただ感度が通常の2次抗体よりもやや低くなりますので、見たいもののシグナルが微弱のときは向かないかもしれません。 また、事情が許すならば両方を組み合わせればかなり改善されると思います。

(無題) 削除/引用 No.102-2 - 2009/02/26 (木) 15:40:48 - ドクタースランプ rabbit IgG が多量に泳動されているので、抗 rabbit IgG（二次抗体）が反応してしまうわけです。 種が変われば、当然起きません。

Dynabeadsを用いた免疫沈降 削除/引用 No.102-1 - 2009/02/26 (木) 13:51:13 - IP 哺乳類の神経培養細胞あるいは脳の抽出液を用いて免疫沈降をしているのですが、バックグラウンドの高さに困っています。rabbit Dynabeadsを使ってrabbit polyclonal抗体でIPして、ウェスタンでくっつく蛋白質を検出という普通の流れでやっていますいますが、preimmuneを使ったネガコンでもバックがでてしまいます。preclearingもやっています。レーン全体がスメアになってしまう感じです。ただ、問題があるのは検出にラビットの抗体を用いた場合だけで、マウスの抗体ではバックはほとんどでません。ProteinA dynabeadsでもバックは高く、proteinAセファロースだともっと高いバックがでました。 また、逆にマウスの抗体でマウスダイナビーズでIPした場合には、マウスの抗体でウェスタンをするとスメアになってしまいます。 どなたかこのような経験をされた方はいらっしゃいますか？どのようにして改善されていますか？よろしくお願いします。

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