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(無題) 削除/引用 No.1015-16 - 2009/08/09 (日) 18:02:44 - み siRNAオリゴなら大抵ハズレナイ。あとは導入効率の問題だけ。 shRNAはハズレが半分はある。あたりでも効率悪い。

あれ 削除/引用 No.1015-15 - 2009/08/09 (日) 12:37:50 - Tb > 調べてみたところ、ＡノックアウトMEFが手に入るかもしれないことが分かりました。 あれ？ KO作ったところはWesternしてないのですか？ shRNAはけっこう、というか、かなりはずれます。売っているものでも。抗体のはずれ以上です。transfectionあるいはinfection efficiencyもかなり高く出せる状況でないと判定も微妙です。薬剤セレクションができたり、GFPマーカーが付いているベクターも多いですが。。。便利な手法だと思いますが、KD成功するまでが大変と感じています。

(無題) 削除/引用 No.1015-14 - 2009/08/09 (日) 12:29:17 - おお >[Re:12] ・・・さんは書きました : > 抗体の吸収を行っても、確実にそれとはいえません。 > クロスリアクトする領域をもったノンスペがメジャーに検出されているようなケースだと、ノンスペが吸収で消失します。KOが手に入るならそれと、それのコンプリメントがいいですね。 細かい解説(フォロー)ありがとうございます。 解説はしよっていましたから、、、、

(無題) 削除/引用 No.1015-13 - 2009/08/09 (日) 12:16:40 - Tb > 両方ともやる価値があるとはおもいますが、、、、 > どちらにしても完璧ではないとおもいますが、、、 そうですね。わたしのは完璧な方法とかいうのではなく、初め押さえておきたいこと、という意味です。 Ｓ社というのがたびたび話題になる会社だとして、ザンキさんも書いておられるように、全く使えない抗体が商品にあったりするので、まずは最低限過剰発現細胞には使えることを確認する、と。これをパスしたからなんだってことはありませんが、パスしない抗体も存在したりしますし。。。まあ、かってに疑いのスタンスをとってました。 一方で、強制発現で40kDaがでればそういうフォームも存在すると前向きに考えていいんじゃないかとも思いますが。。。

(無題) 削除/引用 No.1015-12 - 2009/08/09 (日) 11:58:36 - ・・・ 抗体の吸収を行っても、確実にそれとはいえません。 クロスリアクトする領域をもったノンスペがメジャーに検出されているようなケースだと、ノンスペが吸収で消失します。KOが手に入るならそれと、それのコンプリメントがいいですね。

皆さん、ご指導ありがとうございます！！ 削除/引用 No.1015-11 - 2009/08/09 (日) 11:45:57 - まさお ＞おおさん ご意見ありがとうございます。 現在、マウスＡに対するshRNA発現ベクターを作製しております。 ただ所属する研究室では、あまりshRNAの経験がないため少々不安です。 調べてみたところ、ＡノックアウトMEFが手に入るかもしれないことが分かりました。 もし手に入ったとした場合、この細胞で50or40にバンドが出ないことが分かれば、50or40のバンドがマウスＡによるものと証明できるのでしょうか？ よろしくお願いいたします。

皆さん、ご指導ありがとうございます！！ 削除/引用 No.1015-10 - 2009/08/09 (日) 11:38:13 - まさお ＞免疫組織化学初心者さん ご意見ありがとうございます。 なるほど、ペプチドをつかって抗体を吸着させるのですね。 さっそく検討してみたいと思います！

皆さん、ご指導ありがとうございます！！ 削除/引用 No.1015-7 - 2009/08/09 (日) 11:30:43 - まさお ＞ザンギさん ご意見ありがとうございます。 教えていただいたリンク先で検索してみましたが、やはりマウスタンパク質Ａを認識する抗体はSa社しか販売していないようです。 私が言っていたcDNAの長さとはCDSの長さのことです。 申し訳ありませんORFについては調べておりませんでした。ORFとは何なのか、どうやって調べるものなのか、教えていただけると幸いです。 よろしくお願いいたします。

皆さん、ご指導ありがとうございます！！ 削除/引用 No.1015-6 - 2009/08/09 (日) 11:23:54 - まさお ＞Tbさん ご意見ありがとうございます。 現在、マウスタンパク質Ａ強制発現細胞を作製中です。 プロセッシングに関してですが、 ヒトタンパク質ＡのＣ末端を認識するポリクローナル抗体を作製した方の論文では、約60kDaのバンドの他にも約50kDaにバンドが検出され、この方はＮ末端がtruncateされたものではないかと書かれていました。 私がS社から購入した抗体もＣ末を認識するとされています。ただ、マウスでそのようなtruncateの報告はなく、もし同じ様にtruncateされるとしても約60kDaのバンドが全く検出されないのはなぜなのか分かりません。

(無題) 削除/引用 No.1015-5 - 2009/08/09 (日) 10:46:52 - おお >[Re:4] 免疫組織化学初心者さんは書きました : > > つまり抗体の吸収を行うんです。 > > >少しでも疑わしいと思うなら、発現ベクターをつくって、強制発現させた細胞をポジコンとしてみてみるべきです。 > > こんなことをしても仕方ありません。強制発現されたA　もor/andは認識できるということしか言えません。 両方ともやる価値があるとはおもいますが、、、、 どちらにしても完璧ではないとおもいますが、、、 細胞であればKDができるようになったので、 それで確認する方もいらっしゃるのではと思います。 KOマウス(動物)で確認というのもマテリアルが 手に入るなら可能かとおもえます。

(無題) 削除/引用 No.1015-4 - 2009/08/09 (日) 10:21:00 - 免疫組織化学初心者 >少しでも疑わしいと思うなら、発現ベクターをつくって、強制発現させた細胞をポジコンとしてみてみるべきです。 それでは解決しないと思いますよ。 それより、ブロッキングペプチドを使ってシグナル40 or/and 50 kDaのバンドが消失するかを確認すべきです。 つまり、マウスタンパクAを含むタンパク溶液をSDS-PAGEします。 その後、Aに対するポリクロでブロットする前に、その「ポリクロ」と「ポリクロを作成した際にウサギに免疫したペプチド」を混ぜ混ぜすることで「ポリクロとタンパクAとで抗原抗体複合体」を作らせます。 あとは、この「抗原抗体複合体」を「一時抗体」として用いれば、きっと特異的な抗体であれば、50 and/or 40 のバンドは消えるでしょう。 つまり抗体の吸収を行うんです。 >少しでも疑わしいと思うなら、発現ベクターをつくって、強制発現させた細胞をポジコンとしてみてみるべきです。 こんなことをしても仕方ありません。強制発現されたA　もor/andは認識できるということしか言えません。

(無題) 削除/引用 No.1015-3 - 2009/08/09 (日) 07:15:16 - ザンギ Sanata Cruzでしか売られていない抗体なら用心したほうがいいかも。 ここで調べましたか？ http://www.biocompare.com/ProductCategories/2045/Antibodies.html ところで >マウスとヒトでcDNAの長さにはほとんど差はありません。 ここでのcDNAとはORFあるいはCDSのことですか？

(無題) 削除/引用 No.1015-2 - 2009/08/09 (日) 05:36:52 - Tb 少しでも疑わしいと思うなら、発現ベクターをつくって、強制発現させた細胞をポジコンとしてみてみるべきです。 でも、S社はなんで60kDaのものを40kDaだと書いているのか不思議です。プロセッシングされるとか知られていないのですか？

本当に目的のタンパク質？！ 削除/引用 No.1015-1 - 2009/08/09 (日) 03:57:16 - まさお こんにちは。いつも大変勉強させていただいております。 今年から実験を始めた大学院生です。 現在、ウエスタンブロットを用いてマウスタンパク質Ａの発現における薬剤Ｂの影響をみております。Ａに対するポリクローナル抗体はＳ社から購入しました。 数回の条件検討の結果、約40kDaと約50kDaに2本のバンドが検出できました。ともに薬剤Ｂは抑制的にはたらいているようだということもわかりました。 Ｓ社のデーターシートにはMolecular Weight:40kDaとなっているのですが、他の論文でマウスタンパク質Ａをみている論文が見つからず、本当にこのデーターシートを信頼していいものか分かりません。 ヒトタンパク質Ａは約60kDaというのはわかっており、マウスとヒトでcDNAの長さにはほとんど差はありません。 約40kDaのバンドが本当にマウスタンパク質Ａ由来のものであると確認する方法は何かないでしょうか？どなたかご教授願えないでしょうか。

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