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(無題) 削除/引用 No.1013-10 - 2009/08/12 (水) 10:27:01 - おお >[Re:8] GFPさんは書きました : > 　　　HisTag付きのAcGFP融合タンパク質をHisカラムで精製後（イミダゾールが含まれています）、どのように保存したら良いのでしょうか？ということです。 > > 　　　今は４℃保存しているのですが、沈殿（タンパク質の変性）や蛍光特性の損失が怖いです。一方、冷凍保存するとこれも蛍光が失われるのではないかと不安です。 凍結しても融解するときに沈殿を生じることがありますので、 沈殿を避けるために凍結というのはあまり判断基準には ならないです。 > 　　　話は変わるのですが、Hisタグ精製後、SDSで精製を確認するとまだまだ複数のバンドがあります。これからさらに、精製度を高める実験として何かありますでしょうか？Hisカラムにもう１度通すことや陽イオンカラムに通すことが考えられますが。 陽イオン、陰イオン交換カラム、ゲル濾過、疎水性カラム、HAP、プレパラティブ電気えいどう 選択肢は可也あると思います。核酸に親和性があるものや、分泌タンパクであればヘパリン なども使う人があります。 いろいろバンドがあるといけないかどうかはなんともいえません。ある程度クルードでも 実験の評価に耐えられることがあると言うのは事実です。 ただ、大腸菌とかで発現させて、マンマルの細胞にとなるとタンパク以外のものも 気になりますしもう１段階ぐらいはなんかやった方がいいと思えます。 構造解析などでルーチンにやっているところは次にゲル濾過を持ってくるところも多いようです。

(無題) 削除/引用 No.1013-9 - 2009/08/11 (火) 21:07:13 - A GFPではなくYFP融合蛋白質ですが精製後に凍結乾燥して保存しています。 蛍光強度が70%ほどに落ちますが長期保存には適しているのでは？ 分注して凍結乾燥した蛋白質は念のためシリカゲルと共に茶瓶に入れて 保存しています。もちろんものによってはだめかも知れませんが。

返信ありがとうございます 削除/引用 No.1013-8 - 2009/08/11 (火) 12:31:12 - GFP 　　　HisTag付きのAcGFP融合タンパク質をHisカラムで精製後（イミダゾールが含まれています）、どのように保存したら良いのでしょうか？ということです。 　　　今は４℃保存しているのですが、沈殿（タンパク質の変性）や蛍光特性の損失が怖いです。一方、冷凍保存するとこれも蛍光が失われるのではないかと不安です。 　　　このタンパク質の用途といたしましては、細胞に投与して、局在をモニタリングするためです。 　　　 　　　話は変わるのですが、Hisタグ精製後、SDSで精製を確認するとまだまだ複数のバンドがあります。これからさらに、精製度を高める実験として何かありますでしょうか？Hisカラムにもう１度通すことや陽イオンカラムに通すことが考えられますが。 　　　 　　　やはり細胞に投与する際は、不純物はできるだけ無くした方がいいですよね？ 　　　以上お願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.1013-7 - 2009/08/11 (火) 12:24:49 - おお >[Re:6] dddさんは書きました : > >[Re:5] おおさんは書きました : > > 結晶化して室温で保存でもいいんじゃないかなぁ > > タンパク質を結晶化して常温保存って、ラボでルーチンでやってたりします？ > すいません、冗談です、、、流してください。 ただ確立された方法があるなら、、、、 、、、やっぱり言い訳はやめておきます、、、、、、

(無題) 削除/引用 No.1013-6 - 2009/08/11 (火) 11:29:38 - ddd >[Re:5] おおさんは書きました : > 結晶化して室温で保存でもいいんじゃないかなぁ タンパク質を結晶化して常温保存って、ラボでルーチンでやってたりします？

(無題) 削除/引用 No.1013-5 - 2009/08/11 (火) 01:06:13 - おお 結晶化して室温で保存でもいいんじゃないかなぁ

(無題) 削除/引用 No.1013-4 - 2009/08/10 (月) 15:56:20 - tak1 eGFPをヒスタグで精製したことがありますが、50％グリセロールを添加して-20C保存で、半年以上蛍光は保たれていました。

(無題) 削除/引用 No.1013-3 - 2009/08/09 (日) 22:25:10 - TS amiさんがおっしゃるとおり、case by caseじゃないでしょうか。 GFPさんの実験で、GFP融合タンパク質をどのような実験に用いたいのか、が一番重要であり、それを質問文に加えてもらえると、建設的な助言が得られると思います。 わたしの勝手な想像ですが、手技上、精製したGFP融合タンパク質を凍結保存したいが、蛍光強度をできるだけ失わないようにするにはどうしたら良いのか？ということがポイントのような気がしてはいますが。 それなら、いろいろアドバイスがあると思いますよ。 変性を極力避けるための、保存法とかTipsとか。

(無題) 削除/引用 No.1013-2 - 2009/08/08 (土) 18:15:15 - ami ＞一般的に、タンパク質は冷凍保存すると思うのですが、 まずここおかしいと思います、 ＞蛍光タンパク質は、冷凍保存しても良いのでしょうか？ ものによります。

GFP融合タンパク質の保存法 削除/引用 No.1013-1 - 2009/08/07 (金) 19:09:24 - GFP 　一般的に、タンパク質は冷凍保存すると思うのですが、 　蛍光タンパク質は、冷凍保存しても良いのでしょうか？ 　 　よろしくお願いします。

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