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(無題) 削除/引用 No.101-11 - 2009/02/28 (土) 01:21:41 - おお 発現ベクターであればそのようなコンストラクトがうってますね。 あるいは、そのRNAのその領域が複数のエクソンからなっているなら ゲノムをほりこむのも手だと思います。

たとえば 削除/引用 No.101-10 - 2009/02/26 (木) 23:29:20 - obama スプライシングを受けた5'UTRがmRNAに付加されるようなプロモーターを用いてはいかがでしょうか。 たとえばEF-1alphaプロモーターで転写されたmRNAにはプロモーター内の配列（EF-1alphaのexon1-intron1-exon2からなる）が付加されますが、これは転写後にスプライシングを受けます。プライマーの片側をexon1上に設計すれば問題は回避できると思います。 ただし、一般にEF-1alphaプロモーターの活性は非常に強いので、目的のレポーターアッセイに向いているかどうかはわかりません。探せば他にもこのようなプロモーターはあると思います。

ありがとうございます。 削除/引用 No.101-9 - 2009/02/26 (木) 20:08:00 - luc fishさん、bostonさん ご提案ありがとうございました。 PCR産物の長さについては、、、実は150bpぐらいなので検討の価値が大有りです。ありがとうございました。 制限酵素で処理することは思ってもみませんでしたが、アンプリコン内にある配列をきってくれるものがあれば、少量でもすみそうで、よい方法だとおもいました。こちらはすぐに実行できそうなので、やってみようとおもいます。 それにしても皆さん（いままでにコメントしてくださった）のご意見すべてが目からうろこです。 本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.101-8 - 2009/02/26 (木) 18:30:55 - Boston How about restriction enzyme treatment instead of DNase. This won't cleave transcripts.

以前に 削除/引用 No.101-7 - 2009/02/26 (木) 17:33:40 - fish レポーター遺伝子を検出するPCRのアンプリコンの長さを 長くするとバックが消えることがありますよ。 同じように持ち込みDNAに悩まされていた先輩が、 アンプリコンを100bpから350bpにすることでほぼバックを消してました。 アンプリコンが長くなればなるほど、その間がDNAseで切られている 確立が高くなるのでほとんど持ち込みのDNAではかかりませんでした。 参考までに

(無題) 削除/引用 No.101-6 - 2009/02/26 (木) 13:13:38 - luc 中年様、ありがとございます。 さっそく論文読ませていただきます。 ats様、 ありがとございます。 RNA精製は当初TRIZOLで抽出後、DNAse処理をおこなっていたのですが、 ご指摘のとおり完全を期す為にRNeasey + DNase （On column digestion)をおこなっていたのですが、やはり、逆転写しなくても出てくるものもあります。しかもこのシステムは高いです。（いままでにほかの用途ではかなりのRNeasy に関する経験をもっています。） そこで、ここで結果の解釈に苦慮するよりも、イントロンをはさんだPCRをおこなうことで、混入を無視しようと思い、質問しました。

(無題) 削除/引用 No.101-5 - 2009/02/26 (木) 12:40:01 - ats Luciferase遺伝子が導入されたPromega社のpGL4シリーズには、短いですが人工キメライントロンがLuciferase遺伝子の直前に挿入されています。その配列を利用し、Luciferase遺伝子内部にintronを挿入することも可能でしょう。なお、intronにRNA processingに影響する効果がありますので注意してください。 しかし、「DNase処理が不十分なときがある」=「RNA調製（精製度）が一様でない」＝「逆転写の効率が一様でない」と言うことも考えられませんか。 そちらの条件を検討するのが本筋ではないでしょうか。その上でintronを利用しさらに擬陽性を排除し、実験の再現性・質を向上させるのが良いでしょう。

(無題) 削除/引用 No.101-4 - 2009/02/26 (木) 11:27:16 - 中年 ははぁ・・・面白いことを考えましたね。 １）可能だと思います。ただし、発現量や実験条件によってスプライシングの効率が変化する可能性はゼロではないと思います。 ２）ベクターではありませんが、自分でイントロンを挿入してはどうですか。プラスミドを作ろうとしたら、大腸菌のプロモーター様の配列があってタンパク質が発現してしまい、toxicityを示すためにプラスミド増やせないという場合に、人工的なイントロンを導入することで大腸菌中でのタンパク質の発現が起こらないようにしてしまうというトリックがあります。その時に使っているイントロン配列と同じものが使えると思います。文献はいろいろありますが、例えばこれ。 Stabilization of a full-length infectious cDNA clone of transmissible gastroenteritis coronavirus by insertion of an intron. González JM, Pénzes Z, Almazán F, Calvo E, Enjuanes L. J Virol. 2002 May;76(9):4655-61. PMID: 11932433

(無題) 削除/引用 No.101-3 - 2009/02/26 (木) 10:38:08 - luc 通りすがりさん、 ありがとうございました。 ヒト遺伝子が対象です。 哺乳類でもこのような文献があればとおもっているのですが、、、 とにかくこれを参考にいろいろ調べてみようかとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.101-2 - 2009/02/26 (木) 10:27:12 - 通りすがり 生物種は何ですか？ 植物ならヒマカタラーゼイントロンをβ-glucuronidase遺伝子(GUS)に入れたものが有名ですけど http://pcp.oxfordjournals.org/cgi/content/abstract/31/6/805 動物でも似たような例は沢山ありそうな気がしますが．．．

レポーター遺伝子にイントロンを挿入したい 削除/引用 No.101-1 - 2009/02/26 (木) 08:44:34 - luc よろしくお願いします。 　今、mRNAの安定化の実験をしています。非翻訳領域の配列をレポーター遺伝子の前後に挿入した発現ベクターを細胞に導入、レポーター遺伝子のPCRを行い、その結果を見ています。 　実験の関係で一過性発現で行うのですが、問題はDNase処理をしても、プラスミド由来のDNAのコンタミ原因で、結果が悪い時があることです（逆転写なしのPCRで確認）。　 そこで、レポーター遺伝子の内部にイントロンを挿入してこの問題を解決する可能性を考えたのですが、残念ながら自分を含め、周りにそのようなヒトがいません。また、そのような論文や参考書もさがせませんでした。 そこで皆様のお知恵をお借りしたいのですが、 １）そのようなことはかのうです?（その方法に関する参考文献等があれば助　　かります。） ２）購入、または譲渡可能なベクターが存在するのでしょうか？ よろしくお願いいたします。

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