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(無題) 削除/引用 No.1005-17 - 2009/08/12 (水) 13:54:16 - ts3 クライテリオンゲルの細ウエルを使ってゲル1枚で済ます。

(無題) 削除/引用 No.1005-16 - 2009/08/11 (火) 14:59:42 - 中年 裏写りするかどうかに通じる話ですよね。PVDFだとCBB染色できるので、それで一枚目（陰極側）が裏写りしていなければ大丈夫と判断できるでしょう。 私の経験だと裏写りはタンパク質のサイズと持ち込みのSDS量によりけりです。あまり小さいタンパク質でなくて、かつ真面目に転写バッファーで平衡化してあればまず大丈夫だと思っています。 大きいゲルで泳動していた頃は、ウェットタイプだとトランスファーバッファーが沢山要って勿体なかったため、何回か使い回しをしていました。そうすると、だんだんにSDS濃度が上がったのか、大きいタンパク質が写りやすくなった代わりに小さいタンパク質が抜けるようになって行きました。

多分問題なくできます 削除/引用 No.1005-15 - 2009/08/11 (火) 14:23:52 - TSだったけどexTSにします Tbさんの書かれているInvitrogen（うちのはNOVEX時代のですが）のウェット式トランスファーモジュールを使っていますが、これは、スポンジーろ紙ーゲルーメンブレンーろ紙ースポンジースポンジーろ紙ーゲルーメンブレンーろ紙ースポンジというように２枚を直列に並べて行います。pwさんセミドライの場合と違い、今まで通り抜けてきたタンパクによる汚染が起こったことはありません。高分子の時は、メタノール濃度を指定の20%から10%にしたり、真ん中にもう一組転写したり（つまりスポンジーろ紙ーゲルーメンブレンーろ紙ースポンジーろ紙ーゲルーメンブレンーろ紙ースポンジーろ紙ーゲルーメンブレンーろ紙ースポンジ）しても大丈夫でした。ただとんでもなく過大なロード時間／電圧をかければわかりません。個人的な好き嫌いの問題をいえば30-100KDaくらいの発現量の多いタンパクはセミドライやiblotは早くてたくさんできていいのですが、高分子／低分子や量が少ないタンパクをきれいに出したい時は、ロードの条件の調節性の高いタンク式が好きです。

(無題) 削除/引用 No.1005-14 - 2009/08/11 (火) 13:31:14 - ＊ セミドライは端的に一度に大量にbottingできますから、便利ですね。何も考えずに装置一台で八枚は一度にできますから。 装置の機種にもよるとは思いますが、、、、。 セミドライがルーチンで動いてるなら、そちらの方が一度に大量のblottingが可能なので、 高分子量でなければ、セミドライを使う方が効率的な気もします。 タンクでも挟まるだけできると思いますが、それでも一度に八枚が限度？かも。 セミドライは、パワーサプライの能力次第で、更に倍以上はできなくもないと思います。 まあ、あんまし関係ないレスですけど。

(無題) 削除/引用 No.1005-13 - 2009/08/11 (火) 12:16:20 - おお >[Re:12] oioiさんは書きました : > てか二回やれば？ > きれいなスタック作ってる間に一回目が終わるよ 系が働くのが分かっていれば1日費やすほどそんなに時間はかからないので、 質問をぶつけてみただけです。 実際はこの質問ぶつけながらセミドライ2つつかって大量にやってました。 いいサジェスチョンがあれば次にやってもいいかもと思っている次第です。

(無題) 削除/引用 No.1005-12 - 2009/08/11 (火) 11:56:44 - oioi てか二回やれば？ きれいなスタック作ってる間に一回目が終わるよ

(無題) 削除/引用 No.1005-11 - 2009/08/11 (火) 00:36:29 - おお ラボに10年前のだれも使わないやつとかあるので そういう意味ではしばらくの間はやるなら大丈夫 かもしれません。 わざわざありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1005-10 - 2009/08/11 (火) 00:31:36 - TS >透析膜もセロファンだった。。。 >最近手に入らないんだよなぁ、、、ラップ用はなんかコート >しているようで、水はじいちゃうし。。 メンブレンそのものを代わりに使っても、実質的に汚染されなそうな気がしますが。少しだけコストがかかりますけど、たいしたことないですよね。

(無題) 削除/引用 No.1005-9 - 2009/08/10 (月) 13:19:46 - おお >[Re:8] ザンギさんは書きました : > ゲルやメンブレンを通過する時と、バッファーの中を泳ぐ時では、移動の > 速さが違いますので、そのあたりも勘案なさってください。 あっそうか。 > > セロファンは吸着材というよりは．．． > 半透膜ですから大きいタンパク質は通過できないはずです。 あっそうか。 透析膜もセロファンだった。。。 最近手に入らないんだよなぁ、、、ラップ用はなんかコート しているようで、水はじいちゃうし。。。

(無題) 削除/引用 No.1005-8 - 2009/08/10 (月) 13:16:11 - ザンギ ゲルやメンブレンを通過する時と、バッファーの中を泳ぐ時では、移動の 速さが違いますので、そのあたりも勘案なさってください。 セロファンは吸着材というよりは．．． 半透膜ですから大きいタンパク質は通過できないはずです。

(無題) 削除/引用 No.1005-7 - 2009/08/10 (月) 12:53:02 - おお >[Re:6] Tbさんは書きました : > InvitrogenのNupage gel用のウェット式トランスファーモジュールの説明書に、2枚同時にトランスファーするのは、ゲル・メンブレンサンドイッチをただ単に重ねていれるだけとあったと記憶しています。あんまりも漏れって現実としては問題にならないということでしょうか。。。でも、メタノール濃度は通常10%を指定しているのに対し、20%にしろとあったような。これが漏れ防止策なのかもしれませんね。 ありがとうございました。 確かに漏れというのは条件にも依存しそうです。 私はセミドライでやるのが大抵ですが、裏の方まで 行っていることはほとんどないので、それに近い条件なら まあ大丈夫かなって思ってはいますが、、、

(無題) 削除/引用 No.1005-6 - 2009/08/09 (日) 13:00:03 - Tb InvitrogenのNupage gel用のウェット式トランスファーモジュールの説明書に、2枚同時にトランスファーするのは、ゲル・メンブレンサンドイッチをただ単に重ねていれるだけとあったと記憶しています。あんまりも漏れって現実としては問題にならないということでしょうか。。。でも、メタノール濃度は通常10%を指定しているのに対し、20%にしろとあったような。これが漏れ防止策なのかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.1005-5 - 2009/08/08 (土) 02:26:38 - おお >[Re:3] qwさんは書きました : > 間にセロハンとか透析膜を入れないと、後ろのゲルが汚染します。 > セミドライではそうなりました。 ありがとうございました。 汚れちゃいますか、、、間にスポンジがあっても、、、、 2つホルダーを入れるぐらいだから大丈夫かと、、、 確かに距離は近いですけどね、、、、 セロファンは吸着ざいとして使えるんですね、、、 同じセルロースの濾紙はだめでセロファンならOK 何ですね。 間にブロッティングようメンブレンを挟めば、、、 ぜいたくな実験になりそうです。

(無題) 削除/引用 No.1005-4 - 2009/08/08 (土) 02:20:59 - おお >[Re:2] じょじょさんは書きました : > パッドの厚みはどうなるんでしょうか？ > 挟まるのかしら。 真ん中にスポンジをいれて両サイドは濾紙だけにしようかと おもったので、厚みはコントロールできると思います。

(無題) 削除/引用 No.1005-3 - 2009/08/07 (金) 15:16:30 - qw 間にセロハンとか透析膜を入れないと、後ろのゲルが汚染します。 セミドライではそうなりました。

(無題) 削除/引用 No.1005-2 - 2009/08/07 (金) 15:12:09 - じょじょ パッドの厚みはどうなるんでしょうか？ 挟まるのかしら。

バイオラットのウエットのブロッティングで 削除/引用 No.1005-1 - 2009/08/07 (金) 09:28:51 - おお バイオラットのウエットのブロッティング用のタンクは2つホルダーを入れれるので同時に2枚のトランスファーができます。 そこで、一つのホルダーに濾紙、メンブレン、ゲル、濾紙、スポンジ、濾紙 メンブレン、ゲル、濾紙というふうにはさんで2枚のトランスファーができれば、一つのタンクで4枚同時に出来る勘定になります。 どうでしょうか、、、、やったひといるかなあ、、、、、

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