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(無題) 削除/引用 No.1003-10 - 2009/08/09 (日) 19:48:33 - りあるたいむPCR Pumpkin さん ありがとうございます。 どちらで行うにせよ、しっかり氷上もしくは冷却して調製しようとおもいます。 あと、CYBRではなくSYBRですね。 調べもせずに、ずっと思い違いをしていました。

(無題) 削除/引用 No.1003-9 - 2009/08/09 (日) 19:13:56 - Pumpkin >「データの信頼性」に関しても、現在はそこまで問題にはならない これはどちらにせよ、あなたの技術的な問題に終始するように思えます。 >冷却装置（金属のブロックを冷やしたもの）の上でサンプル調整 サンプル「調製」は、氷上で行ったほうがいいです。理由は非特異的増幅を可能な限り減らす。これにつきます。もちろん、最近は多くのものにTaq抗体が付いていますが、Hot-startに対してCold-startという言葉もあります。装置を使うかどうかは、それがあるかどうかによりますが、ブロックがあればそれを氷上に乗せた方が万一の氷などのコンタミを防げると思います。 ところで、トピ主さんはCYBRといっておりますが、SYBRでないのですか？CYBRは特定商品名でしょうか？

ありがと 削除/引用 No.1003-8 - 2009/08/09 (日) 15:43:49 - リアルタイムPCR 皆さん、ご回答ありがとうございます。 費用面ではCYBR　GREENが優れているとのことでしたが、最初の考えでの「データの信頼性」に関しても、現在はそこまで問題にはならないとのことなので、CYBR GREENでの実験を考えようと思います。 ちなみに、実験操作の面ではどちらが簡単ですか？ 話を聞く限りでは、CYBRをおこなっているときに、冷却装置（金属のブロックを冷やしたもの）の上でサンプル調整してるみたいですが、Taqではそんなことをしている人を見たことがないのですが、酵素の違いの影響ですか？それとも、それぞれの研究室の考え方などの違いですか？

(無題) 削除/引用 No.1003-7 - 2009/08/07 (金) 17:47:23 - ザンギ >Pumpkin様 フォローありがとうございます。 #CyberではなくてCYBRが正しいですね。お恥ずかしい。 ある程度経験を積むと（痛い目に会うと？）、コストと時間（手間）の 問題にシビアになりますね。 以下、重複になりますが、より具体的にはこんな感じかと思います。 半定量PCRや翻訳産物量などから、ある程度結果の予想がついている場合で 確認目的や論文作成用にデータが欲しいような場合には、検証済みの TaqManが手っ取り早くていいです。 へたに独自設計のCYBRで最適化に手間取ってPCR酵素を使うくらいなら、 TaqManでサクッと結果を出すほうが安い場合もあります。 多数の検体を測定する目的なら市販の検証済みTaqManではとてもコストが かかりますし、複数の遺伝子を測定対象にしたら掛け算でコストが増えます。 CYBRで頑張って最適化するほうが確実にコストを抑えられますね。

(無題) 削除/引用 No.1003-6 - 2009/08/07 (金) 16:04:40 - Pumpkin TaqmanプローブかSYBRかという悩みは、ヒトやマウス、ラットといったモデル生物の場合によく起きるんじゃないでしょうか。 私のようなマイナー生物を扱っていると、問答無用でSYBRという選択肢になってます。もちろんコストが一番の要因ではあります。 （ゲノム解読されていないので）イントロン、エキソン情報が全くないので、DNase処理を注意深く行い、プライマーの設定もこれまた注意深く行い、QPCR時には−RTで増幅が起こらないことを毎回確認するなどしてSYBRで行っています。 今のところ、非特異的増幅に悩まされたことは、幸運にも一度もありません。ザンギさんのおっしゃるとおり最適化が行えれば、問題ありません。Taqmanは注文してから実験までにちょっと時間がかかりますが、SYBRだったらプライマー注文した翌日には結果が出ます。スクリーニングとかアレイバリデーションで数が多ければSYBR, 目的遺伝子が少ない場合にはTaqmanという選択のしかたもあるかと思います（要はコストなんですが）。

(無題) 削除/引用 No.1003-5 - 2009/08/07 (金) 15:37:02 - 南の島の「み」 Pumpkin様 参考にさせて頂きます．ありがとうございました． あと，リアルタイムPCR様 当方は，SYBRの系で半定量をやっていますが，プライマーの設計に自信があれば（当方は全くありません orz ），もしくは試行錯誤して良いプライマーを設計できればSYBRの系で十分かと思います． プローブにお金かけるよりかマスターミックスを貯め買いした方がいいのかも・・・ やっぱり目的用途別がいいのかなぁ・・・・どうなんでしょう？

(無題) 削除/引用 No.1003-4 - 2009/08/07 (金) 11:05:21 - Pumpkin http://medgen.ugent.be/rtprimerdb/ こことかでしょうか。ご参考までに。

(無題) 削除/引用 No.1003-3 - 2009/08/07 (金) 11:01:27 - 南の島の「み」 トピ主様失礼します． >[Re:2] ザンギさんは書きました : > Cyberでもきちんと最適化すれば、多くの場合には非特異的なシグナル > は抑えられるようですよ。 > 検証済みのプライマー情報を蓄積したデータベースもあるようです。 データベースのURLとか教えて下さい！是非！！ よろしくお願いします．

(無題) 削除/引用 No.1003-2 - 2009/08/07 (金) 09:39:31 - ザンギ コストの問題で使い分けてるのが実情でしょうね。 PCR酵素の値段はCyber用でもTaqMan用でもほとんど変わりませんから、 プローブ代金だけがコストの違いですが、これが高い。 検証済みのTaqManプローブが売ってますが、容量が少なくてすぐなく なってしまう。 独自設計のプローブを検証しようとしても、業者にプローブを合成依 頼するのが普通ですが、ライセンスの問題でラベルの代金が高い。 Cyberでもきちんと最適化すれば、多くの場合には非特異的なシグナル は抑えられるようですよ。 検証済みのプライマー情報を蓄積したデータベースもあるようです。 ご参考まで

リアルタイムPCRについて 削除/引用 No.1003-1 - 2009/08/06 (木) 21:07:33 - リアルタイムPCR 今年から研究を始めた大学院生なのですが、 リアルタイムPCRの件で分からないことがあるので質問します。 大きく分けて、TaqMan方法と、CYBR Greenの方法の二つあるんですが、 皆さんはどちらの方法をどの基準で選ばれていますが？ 自分で勉強する限りでは、TaqManの方が、論文に使われている数も多いですし、メカニズム的に非特異的な検出結果が得られにくいと思うのですが、業者さんに聞くと、CYBR　GREENの方が使われていると聞きました。 今研究室にある機械はどちらにも対応しているみたいですが、どちらを使用すべきか迷っています。 コストは手間の問題だけでどちらか一方を選ぶのはおかしい気がしますし、かといって資金にも限度がありますので… もし、詳しい方がいたら教えてください。

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