BioTechnicalフォーラム [integrinの発現について]

integrinの発現について

No.1002-TOPIC - 2009/08/06 (木) 20:59:08 - いんてぐりん

皆さん、こんにちは

現在、主に上皮細胞やFibroblastを中心にインテグリンのタンパク発現を確認しようと実験していますが、何度やってもうまく検出できません。
ウエスタンブロッティングではSDSサンプルバッファーやUREAバッファを用いておこないましたが、まったく検出できず、
Flow Cyteではかなり微妙な結果のみ検出されています。
どなたかウエスタンやFlow cyteで検出した経験がある方はおられないでしょうか？
もしよければ、少しだけヒントを頂きたいと思っています。
どのステップで注意すべきなのか？抗体はどれを使うべきなのか？
必要であれば、私がおこなった実験条件は記載します。

今後、IFなどで検出を試みるつもりなのですが、その件に関しても、お勧めの抗体などを含めて教えていただけると助かります。
　

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No.1002-11 - 2009/08/11 (火) 01:03:39 - おお

抗体は確かに良しあしもありますし、その抗体がどの程度のものか
よく分かりませんが、１度文献などあたって調査するのがいいかと
おもいます。

同じ抗体を使っている文献は?
どんな条件でタンパクを調せいしているか?
希釈倍率は?
強制発現けいかどうか、、、、

あとウエスタン自身も微妙な方法で手によって感度そのた
大きく違うこともあるかと思います。

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No.1002-10 - 2009/08/10 (月) 13:35:03 - う

？

文献でも、データシートに書いてある図でも
どちでもいいですが、

この抗体は～細胞を使ってウエスタンしたらこうなりました（バンドが出ました）

ということが書いてあるのであれば、「それは検出できる」のです。
それを疑ったら、何も信じることができない。

しかし、データシートよりも、「とある論文でこの抗体を使ってこの実験系で検出してある」
というものを、より信用するべきであると、私は個人的に考える。

同じことをやって出ないのであれば、まずは「下手である」「抗体が悪くなった」とか
考えるということです。

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No.1002-9 - 2009/08/09 (日) 15:34:56 - いんてぐりん

転写は100V（一定）60minでおこなっています。
一応、同程度の分子量の検出は成功しています。

抗体の種類やサンプルの回収法は、いちおう自分なりに論文を参考にしておこなっていますが、アドバイスを頂いたように、精製されたインテグリンを使用して条件検討することが妥当かもしれませんね。

ちなみに、文献的には現在使用しているヒトの細胞でのbeta1, beta 4, alpha1の発現はしていることになっていますが、コントロール群での発現すら確認できずに困っています。

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No.1002-8 - 2009/08/08 (土) 15:05:52 - AP

サイズがかなり大きいのですよね。トランスファーの効率が問題になると思いますが、どういうプロトコールでしょう。なにか工夫はしていますか。抽出方法よりこちらの方がクサイです。

コントロールとしては、精製インテグリン標品を使うというのも手だと思います。それでも検出できないようであれば、材料のせいでも抽出法方のせいでもなく、どこかの手技が不適当ということでしょうな。

データシートをみて、だれでも簡単にそういう結果が得られると考えるのも、うまくいかなかったときに、製品が悪いんじゃないか（抗体だとそういうこともありましょうが）という方向に原因を求めるのも、なんだか、、、

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No.1002-7 - 2009/08/08 (土) 07:51:45 - おお

integrin beta-1, beta-4, alpha-1をタンパクレベルで発現している細胞がポジコンです。

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No.1002-6 - 2009/08/07 (金) 20:22:20 - いんてぐいん

実験の、というか、タンパク検出の初心者なんで、勉強不足を否定できないのですが、抗体などのデータシートで表記されているものを当てにしてはいけないのですか？
一応は、それを信用して、高い抗体を購入するわけですし、そこにも参考文献として、その抗体を使った論文は出ているわけですし。

ちなみに、使用しているのはヒトの角化上皮細胞で、見ようと思っているインテグリンはintegrin beta-1, beta-4, alpha-1です。

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No.1002-5 - 2009/08/07 (金) 14:02:37 - う

ポジコン

どの抗体を使っているか

これに尽きる。

どちらも、インテグリンを検出しているデータがある論文を検索して
マテメソを見る。これ常識。

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No.1002-4 - 2009/08/07 (金) 12:14:40 - ami

＞ポジコンは通常どの細胞を使用していますか？

種とインテグリンの中のどれを見たいのかわからないとポジコンも何もないので、だめです。

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No.1002-3 - 2009/08/07 (金) 12:07:01 - いんてぐいん

おおさん

ポジコンは通常どの細胞を使用していますか？