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(無題) 削除/引用 No.9994-12 - 2021/10/26 (火) 20:35:35 - ee rtyuioさん 実験目的は後に使うための物取りですが、このスレの主旨としては純粋な興味です 分野として一般的な手法があるならば、とみなさんの意見を伺っています おおさん たくさんアドバイス頂きありがとうございます Lowryのグルコース許容量は調べてはいたのですが使用培地の数倍は高いので、大丈夫だろうと勝手に思い込んで使っていましたが確認は必要ですね BCAも同じ還元反応からスタートするとはいえ、還元糖まで考慮する必要があるのは知りませんでした となると蛍光のような特異的なものを試してみたくはなります。。 デブリの影響などは気に留めていませんでしたが、これらはすべて0.22フィルターでろ過してますので、濁度の影響はないかと思っています 精製の過程で得た目的タンパクを含まない画分（ELISAで確認）にも、たしかに目的タンパクに近い場所にバンドはありました そういう意味ではSDSの純度は完全に信じられるわけではないですが、だとしてもbradfordの値が下にブレる目的タンパク純度が100%を超える、というのは、やはり系の安定性から見直したほうが良さそうですね

(無題) 削除/引用 No.9994-11 - 2021/10/26 (火) 04:18:18 - おお >還元糖が含まれるのでLowryは可能かと言うと、確かに反応はすると思います。こちらのキットでは上限Glucose 100mMとあります。 リンク忘れていました。 https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0011229_Mod_Lowry_Protein_Asy_UG.pdf

(無題) 削除/引用 No.9994-10 - 2021/10/26 (火) 04:16:36 - おお 培地自身（培養する前）に含まれるタンパク質は組成などから確認してますか。哺乳細胞などでは血清（殆どがBSA）とか、無血清培地でもBSA、フェリチン、インシュリンなどの増殖因子が含まれています。大腸菌などの培地でもタンパクをタンパク消化酵素処理したものを使ったりします。 そういう実験系なら、SDSPAGEのあなたのバンドは、培地由来のタンパクと重なっている可能性があるのではないかと思えます。SDSPAGEにしろ、他の定量法にしろ未使用培地でどれくらいのバックグランドがあるか見ておく必要があるかもしれません。タンパク定量では未使用培地にスタンダードのタンパクを希釈すると、正確性が上がることがある可能性があるでしょう。 まあ、哺乳細胞などで、血清入り培地で培養しているけど、血清を単純に抜いた培地に変えてタンパクを回収するということはあることはあるけど、単純に入れ替えただけだと結構な量がまだ残っている可能性があると思います。 還元糖が含まれるのでLowryは可能かと言うと、確かに反応はすると思います。こちらのキットでは上限Glucose 100mMとあります。培養中にグルコースが吸収、代謝されるなら、その変動とともにバックグランドが動くということになりますので、少し厄介ではあります（培地でスタンダードを希釈したとしても、サンプル中のグルコース量が半分になっていたらその分だけタンパク量が低く見積もられますから）。BCAも基本還元糖は反応します。 定量試薬の選択ですが、Bradfordかなと思えます。また、蛍光で測定する試薬も出てますのでそれでもいいかと思いますが、使用経験もないので感触などお話できません。 Bradfordで数値のばらつきについては、もしかしたら細胞のデブリとか混じっていてそれが測定溶液に混じってしまったら高い値を示しているとか可能性がないでしょうか？もしかしたら高速の遠心（３万から１０万g）でそういうものを除くと安定するかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.9994-9 - 2021/10/25 (月) 21:26:06 - rtyuio この実験の目的はなんでしょうか。後に続く実験のために使うリコンビナント蛋白質を得ることでしょうか。それともその細胞がどのようにリコンビナント蛋白質の産生量を制御しているのかを明らかにすることでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.9994-8 - 2021/10/25 (月) 21:18:54 - ee TSさん とてもきれいにまとめてくださってありがとうございます 補足しますと目的タンパクは抗体で、精製前サンプルはSDS上でもメインバンドですので、アルブミンではなく市販精製抗体をコントロールにしています そこで過去のbradfordでは純度が100%を超えるということが起きるのです ご指摘の反応性の違いやSDSで流れきったとしても、（標準品と反応性が同等の）抗体プラス夾雑、というサンプルですので純度が100を超えることはないと思うのです。。 TPIさん おっしゃる通りです ばらつきの要因を探りつつ あとやるとしたらBCAかなと思っていましたが、FluoProdigeというのもあるんですね！ 重金属が入ってないのは魅力的ですね みなさまありがとうございます 培養上清中の総タンパクを測るゴールデンスタンダードがあるものかと思っていましたが、意外とないものなのですね もう少し他のご意見もお待ちしています

(無題) 削除/引用 No.9994-7 - 2021/10/25 (月) 13:04:26 - TPI >SDS-PAGE（バンド目視）で80-90%の純度にも関わらず >Bradfordで結果がぶれる(60%-150%) >Lowryでは10%という結果です。 発現タンパク質はELISAで定量されているということで、他のHCPタンパクが10%, 目的タンパクは90%くらいであることがSDS-PAGEのバンドから予想される、とのことですね。 培養液をタンパク定量すると、Bradfordでは再現性がなく、Lowry法では過剰評価しているらしい。 ということはBradfordでの再現性のない原因を追究するか、別のタンパク定量法を探すことになるかと思います。培養液のタンパク定量は経験がありませんが、私がよく使っているタンパク定量法はBCA法か、FluoProdigeです。それぞれ干渉物質の濃度が示されていますので、それらを試されてみてはいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9994-6 - 2021/10/25 (月) 10:23:52 - TS SDS-pageと、Lowryとブラッドフォードの結果とのブレというが、どういうことをされているのか少しわかりにくいのですが、以下のようなことでしょうか。 1.目的タンパク質はSDS-Pageで確認していて、そのときに目安としてBSAとかも流していて、ざっくりした濃度や純度がわかっている。 2.一方で、LowryやBradfordで培養上清の総タンパク量を測定すると、どうも計算が合わない気がする。 測定系の違いは考慮していますか。 例えば、LowryやBradfordは特定のアミノ酸などに反応するので、必ずしもすべてのタンパク質で同じ発色は出ない。BSAをスタンダードにすることが一般的ですが、実際はスタンダードによって定量値はずれますね。 あとはSDS-pageのゲル濃度によっては小さいものは抜けちゃいますよね。ペプチドとかがたくさんあれば、それらは抜けて見えないと思いますが、Bradfordなどでは一部は引っかかるはずです。

(無題) 削除/引用 No.9994-5 - 2021/10/25 (月) 08:07:18 - ee あのさん 度々ありがとうございます 銀染までしなくとも培養液サンプルのSDS-PAGE,CBB染色で十分見えており、定性的にはほとんどが目的タンパクであることは示唆されています（目的タンパクの精製市販品も同じバンドのみ） ここまで組み換えタンパクの発現精製が当たり前になっているなら、培養液での総タンパク質を定量する方法（できれば簡便なもの）くらいパッと出るようなものかと思って探しましたが簡単には見つからず。。 そもそも培養液中の定量分析は一般的でないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9994-4 - 2021/10/25 (月) 04:55:22 - あの 培養前後の培養液をサンプルとして、 ふつうの電気泳動、あるいは、二次元電気泳動して、 何らかの高感度の染色するのではダメですか？ たとえば銀染色はかなり高感度です。 もっとも、 この場合、定量では無く、定性というべきだろうけど。

(無題) 削除/引用 No.9994-3 - 2021/10/24 (日) 22:44:25 - ee コメントありがとうございます まず説明不足でしたが基礎は無血清培地ですので総タンパク量の試算は…？と思ってます 今回の主旨である宿主由来夾雑タンパクの定量法についてアドバイスいただけると幸いです 目的タンパクの定量はELISAで行っていますのでそちらは特に問題としていません

(無題) 削除/引用 No.9994-2 - 2021/10/24 (日) 16:30:15 - あの レスがつかないようなので、意見書いときます。 動物細胞の培養での話のようですが、培養液中の総蛋白量に 差が生じるほど、何らかの有意差が生じるほど、タンパク分泌 することは無いことが多い。 たとえホルモン分泌細胞だったとしても。 まずは 培養液に最初から入っている、FBSなり、アルブミンなりの 総蛋白量がどのくらいで、想定される分泌タンパクの量が どのくらいか試算することがオススメ。 多くの場合、イムノアッセイか、ウエスタンブロットとかの 共存するタンパクが多量にあっても、測定できる測定法を 用いて、培養液中濃度を測定するのが一般。 分泌量が少なく、アッセイ系の感度が不足する場合には、 それさえもできない。

培養上清中の総タンパク質定量 削除/引用 No.9994-1 - 2021/10/23 (土) 16:25:30 - ee お世話になっています。 現在組換え細胞を用いてタンパク発現を行っています。 この培養上清中の総タンパク質（宿主由来タンパク）を定量する場合は、どのような方法が一般的でしょうか？ 建前の目的としては、精製操作を行った際に、きちんと純度が上がったことを定量的に示したいと思っています。（本心は下記現象への純粋な興味です。） 現状、SDS-PAGEやELISAの結果からは夾雑の除去や、目的タンパクの回収もできており、精製系はワークしています しかし過去複数回の実験では、培養上清において SDS-PAGE（バンド目視）で80-90%の純度にも関わらず Bradfordで結果がぶれる(60%-150%) Lowryでは10%という結果です。 おそらくSDS-PAGEが正しいだろうと思っているのですが、できれば染色ではなく吸光度等の方法で求めたいです。 測定法が違うので、特に吸光度法での値は異なって当然と思いますが ・Bradfordでの代表的な阻害物質である界面活性剤はなく、毎回の希釈率の差が影響しているとは思えない ・培地中にグルコース（還元糖）があるが、そもそもLowryは妥当？ など、疑問が溢れます もちろんBradfordは手技に不安がないわけではないのですが、まずは一般論を知るため、さらっと文献を見てもこの手の情報を見つけられず（CHOなどはHCPのELISAキットがあるくらい？）、今回お尋ねします。 長々と書いてしまいましたが まずは培養上清中の総タンパク質を測定する際、どのような手法が一般的なのかご教授ください また、もしBradfordやLowryの結果についても知見がありましたら回答いただけますと幸いです よろしくお願いします。

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