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(無題) 削除/引用 No.9971-14 - 2021/11/29 (月) 10:47:13 - くわがた 293TにPEIでトランスフェクションしてレトロウイルスを産生させる際，コラーゲンの希塩酸希釈液でディッシュをコートしています。トランスフェクションからウイルス液回収までに何度か洗浄などで培地交換を行いますので，その間の細胞のロスを抑えるためです。 普通に新田ゼラチンのCell Matrixのプロトコール通りに行っているだけですが，iiさんのご意見とは異なり，私の場合はコート無しに比べて明らかにはがれにくくなっていると感じています。 ・ディッシュの底面全体が濡れる程度の培地を入れ，少し残してすぐ回収 （60 mm dishなら2 mL程度。1.5 mL程度回収し，0.5 mLくらい残す） ・そのままフード内に置いて室温30分以上 ・基本培地で3回ほど洗浄 回収した液は4℃で保存して何度も使い回しています。 コートしたディッシュをすぐに使わない場合はCO2インキュベーター内などで保存しておくこともありますが，基本的には用事調製で使い切ってます。

(無題) 削除/引用 No.9971-13 - 2021/10/19 (火) 18:28:42 - A 補足しますと、Lenti-x 293ではなくでHEK293です。コート無しのシャーレでも接着はしますが、はがれやすかったので、ポリリジンコートしたら免疫染色できるまで接着が強くなりました。

(無題) 削除/引用 No.9971-12 - 2021/10/19 (火) 16:12:23 - A 以前に、私は、ポリリジンコートのディッシュを作成し、HEK系細胞を接着させたことがあります。コラーゲンでダメならポリリジンで試してみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.9971-11 - 2021/10/19 (火) 02:41:22 - おお >[Re:10] iiさんは書きました : > 経験的には、HEK系はコラーゲンコートしても接着は良くなりません。 他の方の経験も伺いたいですね。わたしは確か１度だけやって、その時はよくついていたような、、、 良くならないと言う指摘ですが、質問を見ると極端に悪くなっている印象ですが、、、

(無題) 削除/引用 No.9971-10 - 2021/10/17 (日) 22:57:47 - ii 経験的には、HEK系はコラーゲンコートしても接着は良くなりません。 PEIを10 ug/mlくらいにPBSで希釈して、それで一時間くらい表面処理をすると、良い具合に接着性が向上します。 なおPEIの溶液は1 mg/mlくらいのストック溶液から用事調整します。

(無題) 削除/引用 No.9971-9 - 2021/10/17 (日) 22:38:12 - おお 通常の培養用に処理したDishなどで生育しているなら、まだ自作コラーゲンコートを疑う余地はあると思うので、出入り業者などに聞いてみてコラーゲンコートDishをサンプルなどでもらえるかを聞くか、最小のパッケージで買ってみて、自作と比べながらコート方法を改善していき、それでもイマイチならコートDishを買う方針に切り替えるという手も（本当にそういうコートが必要なら）。 また培養用処理も今は工夫されたものがあり、Cellbindとか言われるコーニングの商品や他のメーカの同等品などが使えるか考えてみてもいいかも。 https://gaftp.epa.gov/Comptox/Staff/ddegroot/Document/Extracellular%20Strategy/Gas%20Plasma%20Treatment/Contact%20Angle/3-6t_CellBIND_Improved_Surface_CLS_AN_057.pdf あと確かNuncともう一社実際にそういう商品を見たことがある。

(無題) 削除/引用 No.9971-8 - 2021/10/16 (土) 18:12:36 - MTA 2日間だけ通常のdishでトライ。密度は高い状態で。 プロトコルにコラーゲンじゃないとなかなか張り付きづらい可能性もある旨が記載されているので、その後、コラーゲンdishを急遽作成し、接着数が圧倒的に増えるも、dishを揺らすと1/4がはがれるくらい接着が弱い。形も球状のままです。 今日1枚だけ継代してみました。 2種類のコラーゲンdishをトライしていて、酢酸希釈した場合は、PBSでwash。水でコラーゲンを希釈した場合は、特にwashせず。web上のプロトコルに従っています。

(無題) 削除/引用 No.9971-7 - 2021/10/16 (土) 10:56:13 - おお Lenti-x 293tは使ったことないのだけどきっと２９３Tの亜株だと思うし、普通にコートなしの培養用処理されたDishに結合すると思うけど。。。 なのでそのコラーゲンコートDishにまく前は普通のDishで培養してたのかなと勘ぐってしまう。その場合わざわざコートしたDishで変なのだから、コーティングになにか変なことがあったのかと思えるのだけど。まさかと思うけど、コートしたあとはPBSで洗ってるよね。

(無題) 削除/引用 No.9971-6 - 2021/10/16 (土) 10:27:04 - ななし 撒いた密度が低すぎるのでは？ 293Tはほかの接着性細胞株と比較しディシュへの接着性が悪い。一方、横へのつながりは強く、近隣の細胞と連携して扁平に伸びて基底に接着している感じ。密度が低いと隣との接着がなく、丸まって見えるし、ディシュを動かしていると剥がれたりすることも。

(無題) 削除/引用 No.9971-5 - 2021/10/15 (金) 16:38:04 - mp Lenti-X 293T使っていますが通常のdishでも接着性は全く問題ないです。dishは接着細胞用に処理してあるものを使ってますか？何か根本的なところに問題がある気がします。

(無題) 削除/引用 No.9971-4 - 2021/10/15 (金) 13:56:41 - -_- 細胞を起こしたとき、球状のそれが沢山できて何かと思ったけど、トリプシンではがしてもう一度まいたら通常と思われる形態になったことがあります。 理由は私も知りたいです。

(無題) 削除/引用 No.9971-3 - 2021/10/15 (金) 13:48:32 - -_- 球状のそれをトリプシンでばらしてもう一度まいてもはりつきませんか？

(無題) 削除/引用 No.9971-2 - 2021/10/13 (水) 13:53:17 - MTA 正確に言うと接着しているものもごく少数あるけれども、球状で、はっきり接着していると言い切れない、が正しい表現です。

Lenti-x 293tが接着しない 削除/引用 No.9971-1 - 2021/10/13 (水) 13:35:08 - MTA Lenti-x 293tが接着しないのですが、どうしたらいいのでしょうか。 コラーゲンを自分で張り付けたdishを使用して、DMEM, FBS, 抗生剤なしで培養を開始しましたが。。。 コラーゲンは、rat tail type 1を水か0.02N酢酸で50ug/mlまで希釈して、37℃で2時間インキュベーション、その後、使用です。

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