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(無題) 削除/引用 No.9958-11 - 2021/10/09 (土) 03:23:52 - vbんm、 10KDaくらいの低分子量蛋白質の場合、SDSの結合量とかアミノ酸組成の偏りとか分子サイズ以外の要因の影響がしばしばとても大きくなるので、移動度が正確な分子量を反映しないことが時々あります。

(無題) 削除/引用 No.9958-10 - 2021/10/08 (金) 08:27:57 - おお １４％１０kDaがBPBより先に進むのは、バッファーシステムが何かによるのかもしれませんが少し不安です。ただ古いBPBとか、多分溶かしたときの状態とか、もしかしたら濃度とかで結構遅れるポピュレーションがあることも確かです。 たとえばBPBのかわりにCBBを使うことがあり、そちらのほうが先端を走るようです。濃度はTris-Tricineのプロトコールを見てみるといいでしょう。その他Poceau Sをつかう商品がありましたが、還元剤存在下でボイルすると少し赤黒くなるみたいで、その商品は確かボイルのあとに加えるようなInstructionがあったように思います。サンプルの先端とどれくらいずれるのかPonceauの場合はわかりません。 そういうこともあるので違うDye （CBBとか）を使って、それでもDyeの位置が変だったらバッファーに問題があるのかもという風にしていってもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.9958-9 - 2021/10/07 (木) 16:30:37 - 774 BPBのラインと泳動先端が一致しないのは割とよくあることだったと思います。 Bio-Radがその辺の資料を出していたと思う。 何年か前のテクニカルセミナーで見た覚えがあります。 泳動装置のメーカーにバッファー組成と検出したいタンパク質やサンプル調製法を伝えれば何かしらアドバイスがもらえるかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.9958-8 - 2021/10/07 (木) 13:05:10 - D3 おお様 マーカーもブレることがあるということですね。 BPBで判断しています。 転写後にBPBが止まったところがポンソーで濃く染まるので、BPBが止まったところよりも下（分子量が小さいところ）は流れていないものと判断していました。 そのため、BPBが止まったところより下にある10kDaが検出されており、マーカーがサンプルより早く流れたのではないか？と思った次第です。 他の論文を見てみると推定分子量通りという感じですが、どうやらポジコンを作ってしまった方が早そうですね。 ありがとうございます。 TS様 分かりづらくて申し訳ありません、、、 下限云々というお話はおお様へのコメントの通りです。 先行研究で既にいくつも報告されているタンパク質を検出になりますが、原因がよくわからないのでポジコンを作るのが早そうです。 ポジコンも作れる見込みがあるのでやってみます。 ご連絡ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9958-7 - 2021/10/07 (木) 12:56:35 - D3 qq様 Tris-Tricin/SDS-PAGEも検討してみます。 他にいい方法を提示くださった方がいますのでそちらで検討してみたいと思います。 ありがとうございました。 そば様 ご返信ありがとうございます。 マーカーだけ泳動が早いということです。 確認したところ、若干バッファーの組成が違うようです。（特にSDSの濃度） 以前95kDaのものをウエスタンしたときは問題になりませんでした。 低分子のものを分離する際に問題となる可能性があるようです。 サンプルバッファーとマーカーは既製品を使用していますが、例えば、サンプルバッファーをマーカーと混合して流せば改善する可能性はあるでしょうか？（もちろんやってみないと分からないことですが、、、）

(無題) 削除/引用 No.9958-6 - 2021/10/07 (木) 08:20:18 - TS ものすごく説明がわかりにくいですね。。。 結局のところ、17kDaに検出されるべきタンパク質が予想外のところに見えていて、しかも複数のバンドが見えるということでしょうか。 目的の分子量付近のマーカーの分離が見えているなら、SDS-Pageはちゃんとできていて、 単に抗体の特異性の問題のように感じましたが違うのかな。 市販のマーカーを使っていて問題になったことはないです。 気になるなら、マーカーのサンプル（試供品）ももらえると思いますので、 それも一緒に流してみることもできるでしょう。 抗体の特異性の問題はしばしばあることなので、他の方がおっしゃるようにKO、KD、強制発現などで確認したらよいと思います。 サンプルが流れた下限、というのはなんでしょうか。BPBのラインかな？

(無題) 削除/引用 No.9958-5 - 2021/10/07 (木) 02:18:08 - おお >バンドの位置を特定したいと考えています。 KDやKOを考えたほうがいいのではないかと思われます。それか低発現であるとわかっているものと高発現とわかっているものの比較とか。その蛋白は新規のものなのでしょうか、先行研究やその抗体が売っているものならカタログなどにあるイメージがヒントになることはあると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.9958-4 - 2021/10/07 (木) 02:09:04 - おお 仰っていることがよくわかりませんが、推定分子量から外れたところにMigrationする蛋白はそれなりの頻度で見つかります。マーカーも意外とブレることがあります（違うメーカーと比較すると同じMWでも結構ずれていたり、ゲルのバッファー組成が違うとそのぶれ方も変わったり）。 ＞サンプルが流れた下限よりも下の位置にマーカーが検出されます。 サンプルが流れた下限というのはBPBとか色素のことを言っているのですか？クラシカルなSDSPAGEのバッファーを使うとそうでもないですが、バッファーのバリエーションによっては一部の小さな蛋白はBPBより先に流れることもあります。 ＞（サンプルが10-15kDaの位置で止まっているものの、マーカーは10kDaのものがしっかり検出されます） どういう状況か補足説明がほしいところです。サンプルが10-15kDaの位置にあるというのは１０kDaがそれより先に流れていたら、サンプルが10-15kDaという評価は変だし、何が言いたいのかなと思います。

(無題) 削除/引用 No.9958-3 - 2021/10/06 (水) 23:16:45 - そば マーカーだけ泳動が速いということですかね？ でしたらマーカーとサンプルでバッファーの組成やpHなどが違ったりしませんか？

(無題) 削除/引用 No.9958-2 - 2021/10/06 (水) 22:31:53 - qq >マーカーと同じ速度でサンプルが泳動されていることを確認したいのですが、何かよい方法はないでしょうか。 良いかどうかは判りませんが、 １）マーカー ２）サンプル＋マーカー ３）サンプル で流したらどうでしょうか？ １）と２）のマーカーが同じ位置に出ているようで、更にポンソーで２）と３）に（マーカー以外の）違いがなければ、いいんじゃないでしょうか？ Tris-Tricin/SDS-PAGEでウェスタンという方法もあると思いますが、転写に工夫が必要な気もします。

SDS-PAGEのトラブル？ 削除/引用 No.9958-1 - 2021/10/06 (水) 20:13:33 - D3 ウエスタンブロットで17kDaのタンパク質を検出するために、14%のゲルでSDS-PAGEを行いました。 分子量マーカーと一緒にサンプルを泳動したのですが、サンプルよりもマーカーが早く流れるということはあるのでしょうか。 ポンソーで転写後のメンブレンを確認してみると、サンプルが流れた下限よりも下の位置にマーカーが検出されます。（サンプルが10-15kDaの位置で止まっているものの、マーカーは10kDaのものがしっかり検出されます） 抗体があまり特異的でなく、バンドが複数出てしまうようで、バンドの位置を特定したいと考えています。 目的タンパク質の分子量付近では全くバンドが検出されないので別の問題もありそうです。 とは言え、マーカーと同じ速度でサンプルが泳動されていることを確認したいのですが、何かよい方法はないでしょうか。

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