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しつれいしました。293Tです 削除/引用 No.995-8 - 2012/10/05 (金) 15:45:32 - +はひふへほー 中年様　おお様 しつれいしました。293Tです。iphoneからで、Tを飛ばしてしまいました。 >タグ変えるならGFPタグとかだと見易いでしょうけど、、大きいので問題になる >可能性があるというか、そういう指摘はでるとおもいます。C末にGFPーHA-stop >とかにしておいて、発現が確認できたらGFPを制限酵素で切り取ってHAだけに出 >来るとかいうコンストラクトは便利かもしれません。 それいただきです。本当に助かります！ 結果報告します。

(無題) 削除/引用 No.995-7 - 2012/10/05 (金) 15:29:17 - おお >[Re:6] 中年さんは書きました : > まずは高発現の期待できる293TかHeLaにtransfectionしてウエスタンをしてみて、コンストラクトに問題がないことを確認してみてはいかがでしょうか。 T antigenを利用するならCOS7とかでもいいかもしれませんね。 タグ変えるならGFPタグとかだと見易いでしょうけど、、大きいので問題になる可能性があるというか、そういう指摘はでるとおもいます。C末にGFPーHA-stopとかにしておいて、発現が確認できたらGFPを制限酵素で切り取ってHAだけに出来るとかいうコンストラクトは便利かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.995-6 - 2012/10/05 (金) 15:15:15 - 中年 5000bpくらいと仰っていますが、長いcDNAだからといって必ずしも発現しにくいわけではないでしょう。もちろんそういう傾向はあるとは思いますが。 まずは高発現の期待できる293TかHeLaにtransfectionしてウエスタンをしてみて、コンストラクトに問題がないことを確認してみてはいかがでしょうか。

お礼 削除/引用 No.995-5 - 2012/10/05 (金) 09:33:05 - はひふへほー KY さま おっしゃるとおりです。WBが最適だと考えます。 ただ、細胞内局在を見たくて免疫染色を優先したところに落とし穴があったように思われます。 因みに、ご指摘のシークエンスはチェック済みで、ポジコンは、細胞質に発現するN末にmycをつけた蛋白の過剰発現ベクターで行いました。 pcDNA3.1って確か、５０００bpぐらい発現してくれたような、、、。そこもお聞きしたかったポイントでした。 おおさま ありがとうございます。Kozakもチェックいたしましたので、間違いなく、全長から、stop sequence等の挿入、削除ミスなどは、回避されていると考えます。 CAGプロモーターでのベクターも検討させて頂きます。特異抗体がまだ無くて、共同研究者の方のアイソフォーム違いの抗体は頂いたので、トライしてみたいと思います。（WB 専用なので、細胞内局在がやはり見づらい） 774さま ありがとうございます。上述の通り、ポジコンは、細胞質に発現するN末にmycをつけた蛋白の過剰発現ベクターで、抗体や免疫染色のポジコンとしました。 ＞個人的にはKYさんが仰ってるようにWBが必須だと考えます。 免疫染色ではエピトープが隠れてる可能性もありますし。 安定性の問題であれば、プロテアソーム阻害剤を加えてみるのも手かもしれませんね。 まさに、そのように思います。みなさま、是非今後結果を報告させて頂きます。もし、ケアレスミスならすいません！

(無題) 削除/引用 No.995-4 - 2012/10/05 (金) 09:02:37 - 774 > トランスフェクションコントロールなど染色のポジコンもおきましたが、mycの染色が293細胞で認められません。 mycの染色自体（他のタンパク等）はうまくいってるのでしょうか？ 上の文章だとmycの付いた他のタンパクがどうかはっきりしません。 個人的にはKYさんが仰ってるようにWBが必須だと考えます。 免疫染色ではエピトープが隠れてる可能性もありますし。 安定性の問題であれば、プロテアソーム阻害剤を加えてみるのも手かもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.995-3 - 2012/10/05 (金) 03:49:42 - おお もし、そのプラスミドとGFP発現ベクターなどマーカーを混ぜてトランスフェクションして、マーカーが発現している状態で、あなたの物が発言してないなら、ベクターのコンストラクトか、その現在持っているプラスミドの状態を疑わないといけないかもしれません。 場合によってはそのタンパクの安定性はお使いになった細胞内では非常にわるく、検出しにくい可能性もあるかもしれませんが、、、(たとえばエンドのmycの発現は見られない感度で検出しているわけですよね。ヒトの配列をエピトープとしているのでヒトの細胞だと理論的にはひっかかるはず)。 まあウエスタンはしておいた方がいいかもしれません。特異抵抗体はおもちでしょうか? まあ確認実験がどもまで確実かというのはあるのですが、並行してほかのコンストラクトも作ってみてはとはおもいます。タグも違うものもためしてみてはどうでしょうか、トランジェントならCAGプロモーターあたりも考えてみていいかと。ATGから上流の配列もある程度気をつけた方がいいかと思いますのでそのへんも改善の余地があると思いでしたら違うコンストラクトを作る時考慮すればいいかとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.995-2 - 2012/10/05 (金) 01:13:39 - KY １、ウェスタンを行って、Myc抗体で予想される大きさにバンドが確認できるのか？ ２、シークエンスは全長チェックしたのか？ ３、染色のポジコンとは同じような局在を示す（核内とかミトコンとか）を使用したのか？ ４、同じくらい大きなタンパク質でも同じベクター系で発現を確認したことあるか？ これらがすべて確認されているなら、なぜ染色されないのか謎ですね。

5.5kbの新規遺伝子のコンストラクトでタンパクが発現できない 削除/引用 No.995-1 - 2012/10/04 (木) 21:15:54 - はひふへほー お世話になります。 5.5kbの新規分子をrt-pcrで増幅、それを鋳型に、NかC末にmycと制限酵素を付けてpcr をし、pcr-blunt ii topoにライゲーションしました。フレームなどを シークエンスで確認後pcDNA3.1にクローニングし、トランスフェクションコントロールなど染色のポジコンもおきましたが、mycの染色が293細胞で認められません。 ベクターやタグの種類を変えるべきでしょうか?他にいいアイディアありませんでしょうか。よろしくお願いします。

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