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(無題) 削除/引用 No.9929-4 - 2021/09/28 (火) 13:26:02 - おもいつかない >ピペッティングだけでシャーレから細胞を外すのはダメージにはならないのでしょうか。 細胞による差があるのではないかと思いますので、一般論としては答えきれない気がします。そのFACS専門の方に、さらに「ではトリプシンでなければどうするのですか?」と聞いてみることも役立つかもしれません。 細胞の剥離法の一般的な話でいきますと、「トリプシン」といわれている試薬はtrypsin単体とは限らず、trypsinにEDTAが配合されていることも多いです。 https://www.thermofisher.com/jp/ja/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/trypsin/trypsin.html 細胞によってはトリプシンを用いず、EDTAのみでも十分剥離できるものもあります。また、トリプシンよりマイルドな細胞剥離試薬も販売されており、代表的なものに accutase というのがあります。 https://www.nacalai.co.jp/products/entry/d001011.html 繰り返しになりますが、「自分の細胞についてはどうか?」については、ご自身で試して経験することが最も有益であろうと思われます。 FACSソーティングを2回したから細胞のダメージが大きくなるかというと、そこまで関係ないのでは? 必要なら 2 回ソーティングしてもよろしいかと思います。もし、仮にFACSが UVレーザーを装備していたとしても、レーザーの照射時間は一瞬ですから遺伝子変異に至るようなエネルギー吸収には至らないのではないか、と推測されます。結論としては、よくあることだと思います。ただし 2 回のソーティングで純度は上がると思いますが、必ずしも100%になるわけではありません。

(無題) 削除/引用 No.9929-3 - 2021/09/28 (火) 11:46:18 - みみ アドバイスありがとうございます。 FACS専門の方からは、細胞を乖離するのに、trypsinを使うことはまれだと言われました。ピペッティングだけでシャーレから細胞を外すのはダメージにはならないのでしょうか。 また、専門の職員の方には、doubletはなかなか取り除けないから、2回FACSすることもあると言われたのですが、これはよくあることなのでしょうか(光を当てる角度でsingleにカウントされる部分が多数あるそうです)。 細胞へのダメージも気になりますが、問題ないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9929-2 - 2021/09/26 (日) 18:23:39 - おもいつかない 1. single cell のゲートの仕方の一般論は以下の URL の figure 4 をご覧ください。 https://expert.cheekyscientist.com/how-to-perform-doublet-discrimination-in-flow-cytometry/ 2. 細胞によるかと思いますが、お手持ちの細胞に関してはご自身で両方を試されるべきかもしれません。 お使いのソーターが FACS Aria の場合、ソーティングの後の純度は高いことが期待できそうです。しかし 100 % ということは一般的にありません。100 % の純度を得たい場合には、FACS ソーティングの後(あるいはFACSソーティングをせずに)クローニングするのが原理的には一番シンプルかと思います。

FACS sortingで蛍光を発した細胞群を回収する 削除/引用 No.9929-1 - 2021/09/26 (日) 17:19:06 - みみ Cas9/sgRNA導入後に、FACS sortingで蛍光を発した細胞群を回収する実験系を考え、予備実験を行っています。細胞の相互作用を解析しているため、2種類の細胞を混合しているのですが、蛍光を発するのは一方の細胞のみで、他方の細胞は回収したくありません。 予備実験でFACSのデータを得る部分までは来ました。性質上、細胞のaggregationが起こるのは問題ないのですが、よくピペッティングで混合しても全てがsingle cellになるわけではないのですが、とりあえずFACSまでは強硬しています。 質問： 1. 蛍光を発しないコントロールと蛍光を発している細胞がある細胞群の双方をFACSで解析し比較したのですが、どの分画がsingle cellでかつ蛍光を発している細胞群であるのかはFACSの結果を見ただけでわかるのでしょうか？ 2. こういう実験では、ピペッティングでの細胞分離ではなく、やはりtrypsinを使うべきでしょうか。

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