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DNAの破砕 トピック削除
No.9926-TOPIC - 2021/09/24 (金) 09:32:05 - らいむ
いつも参考にさせていただいております。

少量の初代培養をもちいてタンパクを抽出し、Western blottingをしようと考えております。
細胞株を用いて行う場合は、大きめのplateで培養し、SDS入りのサンプルバッファーをアプライし、投げ込み式sonicatorでDNAを破砕していました。
今回200ul程度のサンプルバッファーをアプライすることを考えているため、投げ込み式sonicatorは難しそうです（サンプルのロスが多くなりそう）。
少量の液量のサンプルに対してDNAを破砕する方法としては他に良い方法はないでしょうか？
例えばvortex mixerに長時間かけるとか、Bath Sonicatorとか……？

経験がございましたら是非教えていただけたらと思います。
どうぞよろしくお願いいたします。
　
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バス式で行けます 削除/引用
No.9926-8 - 2021/09/26 (日) 16:17:51 - 774R
95℃の加熱の後に出力の強いバス式ソニケーターで十分行けます。

出力の弱いやつだと不十分かもしれません。ただ、95℃で20分くらい処理するとゲノムが弱くなるのか、弱いバス式のでもいけます。

(無題) 削除/引用
No.9926-7 - 2021/09/24 (金) 16:26:45 - おお
＞できるだけ濃くしないと検出が不可能なため、
＞直接サンプルバッファーを加えることにしています。
RIPA１５０ulでチュ出して４xサンプルバッファーで５０ulでボリュウムで目的のサンプルがちゃんと抽出されていてDNAなどの夾雑物がなく泳動の乱れが少なく検出感度もあがると思いますけど。
抽出力が不安なら１００ulで抽出後遠心したペレットに５０ulを加え更に抽出して両者を混ぜ合わせて１５０ulでもいいし。
RIPAをグリセロール、DTT入にして１７５ulで抽出して２５ulのBPBのはいった２０％SDSを加えてボイルしてもいいし。

できるだけ濃くといっても３mg/ml以上になると違う理由で検出感度に影響が出そう。

(無題) 削除/引用
No.9926-6 - 2021/09/24 (金) 15:10:35 - mp
Benzonaseが楽。ただしMgを加える必要がある。

(無題) 削除/引用
No.9926-5 - 2021/09/24 (金) 13:39:50 - らいむ
おおさん、Iさん

お返事ありがとうございました。
なるほど、シリンジを使う方法が良いのですね！
早速マイジェクターの見積もり依頼を出しました。

※できるだけ濃くしないと検出が不可能なため、
直接サンプルバッファーを加えることにしています。

(無題) 削除/引用
No.9926-4 - 2021/09/24 (金) 12:57:05 - l
補足します。マイジェクターは針がシリンジと一体化してるタイプ（針が外れないタイプ）を使ってます。デットスペースが少ないのでその分ロスがないので。

(無題) 削除/引用
No.9926-3 - 2021/09/24 (金) 12:49:26 - l
少量の時は黄色いキャップのマイジェクター（２９G x1/2、0.33x13mm）使ってます。２００μlあるなら出来るだけ泡だてない様にゆっくり4~5回吸出すればロスは少なくてDNAのせん断もできると思います。泡だらけで液が見えないようになった時は２〜３分ほど遠心すればいいです。

(無題) 削除/引用
No.9926-2 - 2021/09/24 (金) 11:14:00 - おお
２００ulだったらかろうじてニードルに通してDNAを剪断できるでしょう。
あとはマイクロセントリフュージで使うフィルターみたいなものが楽かもしれないけど、どの種類のフィルターがいいかいまいちわからない（むかしGEのRNA抽出キットで、組織のデブリなど除くためのフィルターカップがあって細胞では使わないので余ったやつをそういう目的でたまに使っていた）。

何が何でもSampleBufferじゃないと行けないのでしょうか、RIPA Bufferで５mMていどのMgCl2を加えると大抵の蛋白が溶出し、DNAは溶けてこないのでかなり楽です。

DNAの破砕 削除/引用
No.9926-1 - 2021/09/24 (金) 09:32:05 - らいむ
いつも参考にさせていただいております。

少量の初代培養をもちいてタンパクを抽出し、Western blottingをしようと考えております。
細胞株を用いて行う場合は、大きめのplateで培養し、SDS入りのサンプルバッファーをアプライし、投げ込み式sonicatorでDNAを破砕していました。
今回200ul程度のサンプルバッファーをアプライすることを考えているため、投げ込み式sonicatorは難しそうです（サンプルのロスが多くなりそう）。
少量の液量のサンプルに対してDNAを破砕する方法としては他に良い方法はないでしょうか？
例えばvortex mixerに長時間かけるとか、Bath Sonicatorとか……？

経験がございましたら是非教えていただけたらと思います。
どうぞよろしくお願いいたします。
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