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(無題) 削除/引用 No.9925-5 - 2021/09/24 (金) 12:41:39 - l 既存の論文を参考にすることはあると思いますが、そのまま踏襲というのは今はあまりないと思います。メーカーで独自に研究して細かい条件検討などしたり、他社製品より少しでも良いものをということで商品化したものと思います。 わたしらはお金がないこともありますが、こういったものについては自分らで論文調べたりいろいろ条件検討してオリジナルな組成の試薬やプロトコルでやっております。中身がなんだかわからないものを使って、自分の研究や材料のこと何も知らん人の言うままにやるのはやっぱどうも抵抗あります。

(無題) 削除/引用 No.9925-4 - 2021/09/24 (金) 11:11:05 - toto 以前、共同研究者がこの手の分画キットを使っていて、reviewerから試薬の組成を書くように求められて、結局、manualでやりなおしたことがありました。商売の邪魔をするつもりはないですが、論文の結果を誰もが再現できるようにするには、確かにそのreviewerがいったように、ブラックボックスは最小限にしたほうがいいとは思います。

(無題) 削除/引用 No.9925-3 - 2021/09/24 (金) 08:40:25 - おお 昔からある核内の蛋白の活性などを検出するための方法。 PMID: 6828386 https://www.med.upenn.edu/robertsonlab/assets/user-content/documents/Preparation%20of%20Nuclear%20and%20Cytoplasmic%20Extracts%20from%20Mammalian%20Cells.pdf 界面活性剤は使ってませんが、Buffer Aに界面活性剤を加えるModificationはよく見られます。多分このような方法は生化学実験講座の１０数巻あるなかのどれかに書いてあったと思うし、そこからリファレンスを拾うこともできるでしょう。このほうほうでBuffer Aで核を回収したあとの上清は高速で遠心し、S100というCytoplasmic fractionとして扱われます。 高い塩濃度で核タンパク質を抽出するので、その後透析したりするのが定石ですが、これらのプロトコール通りでやると結構高い蛋白濃度になる（５mg per ml 以上）ので薄めて使ってもOKでしょう。 PMID: 33918601 これもだいたい同じような方法ですが、デタージェントを使ってます。核を洗う段階で塩濃度を生理的な濃度にしてますね。個人的には生理的な濃度の塩だと核内のものがいくらか漏れ出てくるかもと不安ですけど、出てきたとしてもあまり問題がない程度なのかもしれません。 さらに工夫された方法も見つかりますね。 核膜安定化をするような試薬を入れたり、組織から抽出するプロトコール、シュークロースで等張？にあわせたLysis bufferを使ったり、DetergentをNP-4０じゃなくもっとマイルドなDigitoninを使ったり。 PMID: 26740924 https://www.labome.com/method/Subcellular-Fractionation.html#ref2 まあそうなると、、、キットはどのプロトコールかと、、、

(無題) 削除/引用 No.9925-2 - 2021/09/24 (金) 00:54:38 - おお ソースははっきりしませんが（多分このあたりかなというのはあるので時間があれば引っ張ってきますが）、Aは低張のバッファーでマグネシウムが入っていると思います。Bは核膜を壊さないNonidet P-40（の代替品）のようなよわい界面活性剤。 Cは２通りの可能性があるとおもうが使ったことがないのでどちらか検討がつかない。 一つはマグネシウムいりで３００から５００mMぐらいの塩（NaClかKCl）でもしかしたらグリセロールが入っている。 もう一つは１％Triton X-100とかが入った生理的な塩濃度、あるいはそれより少し高い塩濃度のバッファーでこれも多分MgCl２が入っているでしょう。

細胞質分画採取のプロトコルの元ソース 削除/引用 No.9925-1 - 2021/09/23 (木) 19:49:58 - ももんが 細胞質内のタンパク質を解析するために、まずは、キットを用いて核分画と細胞質分画に分けて実験を行っています。 どの社のキットも、概ね溶液A, B, Cが含まれていて、A、Bと順に加えて細胞膜を破壊し、Cで核を破壊しています。 元の論文ソースを調べてもどうしても見つからないのですが、どなたかお分かりの方いらっしゃいますでしょうか。大まかな溶液の組成を知りたいです。 ww.thermofisher.com/order/catalog/product/78835#/78835 ww.cosmobio.co.jp/product/detail/cbl-20140715-7.asp?entry_id=13024

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