BioTechnicalフォーラム [SDS-PAGEゲルの破れ]

SDS-PAGEゲルの破れ

No.9916-TOPIC - 2021/09/16 (木) 20:08:07 - toki

いつも拝見しており、大変勉強になっております。

自身は現在ウェスタンブロッティングを行っています。
SDS-PAGEの後、ゲルをガラス板から剥がす際に、たまにゲルの端の方を2-5mm程度破いてしまいます。

ウェスタンブロッティングでは電気泳動後に転写バッファーでゲルを15分ほど平衡化すると思いますが、ゲルが破れると、ゲルの中のタンパク質に影響はあるのでしょうか？
破れた箇所からゲル中のたんぱく質が転写バッファー中に漏れ出るなんていうことはありえるのでしょうか？

よろしくお願いいたします。
　

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No.9916-7 - 2022/01/15 (土) 01:34:39 - Q

細いスパーテルの後ろ側の平らなところの角とかプラスチックの細くて薄いヘラの角とかでガラス板の左右にあるスペーサーていうのかあれはなんか板みたいなのあるでしょあれとゲルの間がくっついてるのでその境界をビーッってとかなぞるようにして切ってからゲルの角を指でつまんで剥がすと切れないからやってみ。

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No.9916-6 - 2022/01/14 (金) 23:57:20 - おお

ゲル作成のときにガラスが汚れていたり、前に使ったポリアクリルアミドのデブリが残ったまま気が付かずに乾燥させてしまったりしていたり、などでゲルがガラスにこびりついてしまうことがあります。参考までに

無題

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No.9916-5 - 2022/01/14 (金) 17:05:57 - toki

大変お忙しい中、ご教授くださりありがとうございました。
ゲルが破れても中のタンパクに問題ないとの点、安心しました。

今後も何かあった際には是非よろしくお願いをいたします！

(無題)

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No.9916-4 - 2021/09/18 (土) 02:30:43 - おお

>[Re:3] bさんは書きました :
> ポリアクリルアミドの網の目は非常に密で頑丈ですので、一旦引っかかったタンパク質は、無理やり電気で引っ張りだすとかしない限りそう簡単には抜け出せません。なので心配ないと思います。MMPの活性染色などではゲルを反応液に沈めて37度で数時間～一晩とかインキュベーションしますが、特に拡散することなくシャープなタンパク質のバンド見えますし。

まあ、とはいっても一日固定を忘れて放置したゲルをCBBで染色したら拡散が進んでバンドがぼやけてしまったという経験もあります。

(無題)

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No.9916-3 - 2021/09/18 (土) 01:56:33 - b

ポリアクリルアミドの網の目は非常に密で頑丈ですので、一旦引っかかったタンパク質は、無理やり電気で引っ張りだすとかしない限りそう簡単には抜け出せません。なので心配ないと思います。MMPの活性染色などではゲルを反応液に沈めて37度で数時間～一晩とかインキュベーションしますが、特に拡散することなくシャープなタンパク質のバンド見えますし。

(無題)

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No.9916-2 - 2021/09/17 (金) 09:56:04 - おお

１mmとか０.７５mmの厚さのゲルにから出てくる心配をしなくても済むわけだし、、、ゲルの表面付近にも蛋白があるわけだし、、、
経験上あまり問題があったことはありません。
＞転写バッファーでゲルを15分ほど
メタノールが入っていると蛋白が凝縮してしまうかもと思ってしまうのだが、３分もやれば大丈夫なんじゃないかな。私はやらないか、ゲルの組成が特殊でやったほうがいいと判断したときはトリスグリシンのランニングバッファーで５分以内置換してます。

SDS-PAGEゲルの破れ

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No.9916-1 - 2021/09/16 (木) 20:08:07 - toki

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