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(無題) 削除/引用 No.9911-4 - 2021/09/15 (水) 13:09:59 - G25 糞便、土壌などから抽出したDNAで一番問題になるのは、阻害物質を有するために「PCRがかからない」ということでしょう。 「PCRはかかるけどスメアがでる」っていうのは、そういうことではないと見ますが。

(無題) 削除/引用 No.9911-3 - 2021/09/14 (火) 09:52:04 - G25 糞便からのDNA抽出は、それに特化したキットが有るくらいですから、品質の高いDNAを得るのにはそれなりのノウハウがあるのだと思います。宿主由来のDNAを除去するステップなど、結構いろいろな処理がはさまったりしてますよ。そういうキットを使わないにしても、自前で精製したDNAを市販のDNAクリンナップ用のカラムにかけると品質はよくなることが期待できます。 ただ、PCRがかかっていてバンドがスメアになっているというのは、単にPCRのかけすぎという可能性もあると思いますがいかがでしょうか。16Sのバンドはどのくらいの強度で出ているでしょうか。十分に強ければすこしPCRを控えめにするといいかもしれません。 PCRの酵素はどんなのを使っているでしょうか。酵素や添付バッファーの種類によって夾雑物の影響や許容されるサイクル数（サイクル数が多くなったときの増幅の抑制や副産物の発生などに関して）がかなり違います。

(無題) 削除/引用 No.9911-2 - 2021/09/14 (火) 09:50:05 - noname 素直に糞便からDNAもしくはRNAを抽出できるキットを使ったほうが早いと思います。 各メーカー、阻害物質を除去できるように工夫しているはずなので...

糞便から16srRNAゲノムの精製　うまく行かないのは何故？ 削除/引用 No.9911-1 - 2021/09/14 (火) 08:31:47 - わる 糞便を破砕、タンパク質を沈殿させクロロホルム、エタノールを用いてDNAを析出させてTEで解かしたDNAをPCRにかけて16srRNA遺伝子領域を増幅させています。 最終的に内部の細菌のDNA配列を特定したく、細菌種ごとに内部の配列が異なる16srRNA領域を電気泳動で切り出し⇒クローニングにかけ菌種を特定したいのですが、電気泳動にかけた際どうしても16srRNAのバンド1,500bpから上の部分にかけてスメア状のものが形成されてしまいます。 PCRのTm値をいじったり、テンプレートのdna量を変えたりしていますが効果がありません。 コントロールとして大腸菌のDH5αも同様の方法で電気泳動にかけているのですが、こちらはきれいに目的配列の長さのものがバンドとして見えているので、私は糞便内の何らかの物質がPCRを阻害しているのでは、と考えていますが原因が分かりません。 ゲノム抽出の際に入れる試薬に工夫が必要だと考えているのですが、この場合、どのような処理をすれば良いのでしょうか？

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