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(無題) 削除/引用 No.9899-5 - 2021/09/08 (水) 20:24:44 - +zwedfr インキュベーションが長くなると抗体も変になってきて非特異的な反応のリスクは大きくはなるけど、そうではなくてうまくいくときもあるかもしれない。多分、３日間の間に抗原側のエピトープ周囲の変性の状態がゆっくり変化して（一種の不完全なrenaturation)、抗体とうまく反応しやすくなったのではないだろうか。抗体反応前（ていうか正確にはblocking 前）にblotを水中で2、３日おいてから抗体反応に進んだらどうだろうか。 いいか悪いかは別にして、割と偉い系の人でバンドが出るまで何日でもインキュベーションを延長するという人知ってる。

(無題) 削除/引用 No.9899-4 - 2021/09/08 (水) 10:26:52 - AA IHCなんかだと、4度で5晩、というプロトコルを見かけたりもします。 WBとIHCで一概には言えないとは思いますが、反応時間を伸ばすことで見られるということがないとは言えないと思います。

(無題) 削除/引用 No.9899-3 - 2021/09/08 (水) 02:52:02 - mi Total lysatesではなくて膜フラクションを回収するとかそういう工夫はされましたか？　→いいえです そういうことがないと否定する材料はあまりないです。　→それは良かったです。一度ポジティブに向いてみます。

(無題) 削除/引用 No.9899-2 - 2021/09/08 (水) 02:49:48 - おお ＞3日間4℃でインキュベーションしたら急に綺麗なバンドが見られました そういうことがないと否定する材料はあまりないです。ネガコンなどで特異性をみるといいでしょう。系がワークすることを証明すれば疑う材料がなくなります。まあ高い濃度でオーバーナイトぐらいで出来ればいいのかもしれませんけど。 Total lysatesではなくて膜フラクションを回収するとかそういう工夫はされましたか？

3日間4℃でインキュベーション Western blott 削除/引用 No.9899-1 - 2021/09/08 (水) 02:25:12 - mi Western blottついてAffinityの低い抗体で (GPCRタンパク)、色々と条件を変えてもバンドがでないため、 Primaryで、3日間4℃でインキュベーションしたら急に綺麗なバンドが見られました(驚いており、non specificじゃないかと疑っています)。 primaryについては、オーバーナイト以上にインキュベーションしても意味ないと理解していたのですが、インキュベーション時間が長いほどみられるものもあるのでしょうか？

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