全13件 ( 1 〜 13 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.9896-14 - 2021/09/13 (月) 19:02:03 - y >[Re:10] G25さんは書きました : > 直感的には、大腸菌のターゲティングベクターを大腸菌を宿主に使ってコンストラクトするというのは方法論として良いのだろうか？と思います。分野に詳しくないですが、一般的な手法なんですか？ 一度だけ経験がありますが、これ自体は問題ないと思います。コンストラクションに使う株は大抵recA株なので、組み込まれることはまずありませんし、5'armにATGが含まれていなければ発現もしないかと。 コンストラクションが完成した後、古典的にはrecBC sbcBCとかそういう特殊な(相同組換えし易い)株に入れる訳です。(最近はもっといいキットが出てるみたいですが。)

(無題) 削除/引用 No.9896-13 - 2021/09/13 (月) 17:10:38 - h G25さんの > 直感的には、大腸菌のターゲティングベクターを大腸菌を宿主に使ってコンストラクトするというのは方法論として良いのだろうか？と思います。分野に詳しくないですが、一般的な手法なんですか？ に同意します。私も大腸菌主体の実験は門外漢ですが率直に言って、それ大腸菌で発現しちゃうよね？ いやまあ、何も大腸菌に関係しないのならばプラスミド増えそうだけど、それはそれで続ける意味が。。。

(無題) 削除/引用 No.9896-12 - 2021/09/11 (土) 23:46:12 - G25 > 私が疑ったのは、外来遺伝子産物のleaky expressionによる対宿主菌毒性。 もしこのケースなら、培養温度を下げる(室温、18℃など)にすると生えてくることがあります。育つのに時間がかかりますし、pUC系レプリコンだと収量が下がりますけど(コピー数が下がることで毒性が下がるのとトレードオフ)。 最初に、ベクター骨格やデザインのことを尋ねたのは、そういう可能性があるか、だとしたらどういう対策が考えられるかを検討したかったからなんですが(回答はありませんでしたけど)、 oriの種類(コピー数の多さ、温度感受性などに関連)、クローニングサイトがlacPの下流などプロモータの下流にあるか、その場合、プロモータに対するインサートの遺伝子の向き、など。 プロモータ下流にある場合、それに対するインサート遺伝子を逆向きにするとクローニングできることもあります(leaky expression があっても遺伝子産物が出来なくなるため？)。

(無題) 削除/引用 No.9896-10 - 2021/09/11 (土) 23:26:16 - G25 あるいは、形質転換した直後に宿主ゲノムと組換えをしてしまって、内在性の遺伝子の機能不全によって生えてこないとか？ 直感的には、大腸菌のターゲティングベクターを大腸菌を宿主に使ってコンストラクトするというのは方法論として良いのだろうか？と思います。分野に詳しくないですが、一般的な手法なんですか？ overlap extension PCRなどで、線形DNAのターゲティングコンストラクトをin vitroで作るというのではだめかな。

(無題) 削除/引用 No.9896-9 - 2021/09/11 (土) 16:33:49 - tk 皆様のアドバイスを受けて試行錯誤していますが未だ上手くいっていません。 今クローニングしようとしているのは、大腸菌のあるタンパク質（Xとします）のドメインの一部を欠失したもので、後に相同組み換えでその遺伝子を大腸菌のゲノムに組み込もうとしているため、5'UTRと3'UTRも同時にクローニングしようとしています。 となるとプラスミドが正しく組み上がったものだとそのプラスミドからXが発現することになり、G25さんが仰るように、プラスミドが形成したものに限り生えてきておらず、外れを引いている気がしてきました。 そこで内在のXを欠損した大腸菌を使ってクローニングできないものかと考えているのですが、一般的にクローニングに用いられるような株以外（hsdRやendAに変異が入っていない株）でクローニングはうまくいくものでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9896-8 - 2021/09/09 (木) 05:42:08 - oyaji PCRスクリーニング用に、新規にプライマーを設定するのが、良いでしょう。 オリゴは安い。 コロニーPCRなら、せいぜい1000塩基が安タックの限界。 数十コロニー拾ってダメなら、ストラテジー変更。 in fushion、上手くいかないことが多く、私的には辞めました。机の上では、「これとこれと、、、きっと上手くいく」と思いますが、現実は、「さっぱりダメ」ということも多い。 できれば、古典的に制限酵素+リガーゼで、繋げることも念頭に、オリゴを組むのが、安全。バックグラウンドを下げることができれば、結構簡単。

(無題) 削除/引用 No.9896-7 - 2021/09/07 (火) 14:23:41 - むめい コロニーPCRで2800bpって長すぎません？ うちの研究室だと、1000bp以下な気もするのですが、ご参考まで。

(無題) 削除/引用 No.9896-6 - 2021/09/04 (土) 14:36:06 - TAM コロニーPCRはインサートが入っていてもうまくいかないことがあります。ポジコン（インサートが入っているコロニー）があるなら別ですが。 In-Fusionのとき、インサートなしのネガコンはやってますか？インサートありのコロニー数が、インサートなしのコロニー数より３倍以上あるなら、コロニーPCRなどせず、５，６個ミニプレしてゲル電するほうが早いし確実です。

(無題) 削除/引用 No.9896-5 - 2021/09/04 (土) 02:27:41 - おお 細かいことは後で追加できればと思いますがとりあえず。 コロニーPCR自体がそのインサートでワークしてない可能性も考慮して、１２クローンほど実際に大腸菌を増やしてミニプレップしてみたらどうですか？ あまり理屈は説明できない（こともまあまあある）のですがコンピテントの大腸菌株を違うものにかえるとうまく行ったなんて話はたまにありま

(無題) 削除/引用 No.9896-4 - 2021/09/03 (金) 19:05:40 - G25 私が疑ったのは、外来遺伝子産物のleaky expressionによる対宿主菌毒性。 ちゃんと継ったものに限って産物ができてしまって生えてこないとか。

(無題) 削除/引用 No.9896-3 - 2021/09/03 (金) 19:03:19 - G25 ベクター骨格やデザインの概要は？ 発現ベクターとか？ インサートはなにかの遺伝子のCDS?

(無題) 削除/引用 No.9896-2 - 2021/09/03 (金) 18:41:01 - Egeria 初歩的なことになってしまいますが、確認させてください。 (1) コロニーの数はうまくいっているときと比べてどうでしょうか？　激減しているようならIn-Fusion反応効率の低下が示唆されます。コロニーが多数ならば環状ベクターの持ち込みが疑われます。 (2) コロニーPCRに用いるプライマーはベクターにアニールするものを使っていますか？　コロニーPCRはポリメラーゼにとって最適でない条件なので、プライマーや内部配列次第では何度やっても増幅しないことがあります。ベクターにアニールするプライマーなら空ベクターを拾ってもバンドが出るので、増幅しなかった場合とインサートがない場合を区別できます。

In-Fusion PCR（コロニーPCR）がうまくいかない？ 削除/引用 No.9896-1 - 2021/09/03 (金) 16:10:20 - tk あるベクターに２本のインサート（AとBとします）をタンデムに導入しようとしています。 ベクターの線状化とインサートの調製を済ませ、 ClontechのIn-Fusionキットを使用してIn-Fusion反応、 DH5αにトランスフォーム、 コロニーPCR、という流れで実験を行ったところ、望みの長さのフラグメントの増幅は確認されませんでした（2800bpほど）。 そこで、インサートを１本ずつ導入する手法に変更して、まず、Bのインサートを同様に導入してコロニーPCRを行ったところ望みの長さのフラグメントが増幅しました（1200bpほど）。 Bが導入されたベクターを線状化してAのフラグメントを導入してコロニーPCRを行ったところ望みのフラグメントは増幅しませんでした。 In-Fusion反応のための相同配列は全て15bpでプライマーの設計や実験操作に問題は無さそうなので困っています（これまで別のベクターなどで何度も成功しています）。 特に、同じ相同配列でBは導入されてAが導入されないのが不思議です。 AとBをあらかじめPCRで連結してからIn-Fusion反応を行っても上手くいきませんでした。 コロニーPCRにはQuick Taqを使用しているのですが、これに問題がある可能性もあるのでしょうか。 何かアドバイスをいただけると幸いです。

全13件 ( 1 〜 13 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---