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ルシフェラーゼ、基質の細胞膜透過性 トピック削除
No.9892-TOPIC - 2021/09/01 (水) 10:08:45 - ｚｚｚ
いつも勉強させていただいています。ルシフェラーゼと基質の細胞膜透過性について質問です。
トランスフェクション試薬の研究を行っていて、普段はin vitroでレポーターアッセイをGluc+セレンテラジンや、secNluc+bisセレンテラジンなどの、分泌型ルシフェラーゼ＋基質で行っています。
in vitroでのトランスフェクションが順調なのでマウスでin vivo レポーターアッセイをIVISを使って行うことを計画しています。
Luc2+Dルシフェリンの組み合わせでマウスに投与することを予定しています。
Luc2+Dルシフェリンがきちんと機能するか、事前にin-vitroで導入してIVISシステムでチェックしておこうと思っています。
そこで質問なのですが、Luc2のタンパク質は細胞膜透過性なのでしょうか？それとも基質のDルシフェリンが細胞膜透過性で細胞内に入るから発光するのでしょうか？ちなみにLuc2はプロメガ製品のほうのLuc2(pGL4 Vector)です。

JOVEで見つけたプロトコルに従ってin vitroでのチェックも行おうと思うので、実施自体は可能かと思うのですが、ルシフェラーゼ、基質の細胞膜透過性によって培養上清が発光するのか、細胞自体が発光するのか変わってくるかと疑問に思いまして。

ご教示お願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.9892-3 - 2021/09/03 (金) 09:37:57 - ｚｚｚ
おお様

ありがとうございます。
やはり、発現したLuc2は細胞内に限局しているいうことで良さそうですね。
動物実験でLuc2はよく使われているので、もし分泌型であれば、細胞外の間質、血液内に漏出して局在もなにも分からなくなるかと思いますので、やはり細胞内なのだろうとは思っているのですが。

分泌型ルシフェラーゼは細胞を破壊しなくていいので、in vitroで発現効率の経時的な変化を見るのに便利で、普段secNlucの時には培養上清と基質を反応させているのですが、
今回のようにLuc2と基質がきちんと反応するか(IVISで確認できるか)in vitroで確認する場合、

接着細胞にLuc2 pDNAトランスフェクション

24時間後に上清を取り除いて、

細胞と基質/DPBSの反応

IVISで発光の確認
という流れで行けそうな気がします。

(初回は若干不安なので、回収した培養上清も捨てずに取っておこうと思います
が)

(無題) 削除/引用
No.9892-2 - 2021/09/03 (金) 00:54:22 - おお
蛋白が膜透過性というのはよほどのことだと思います。ちらっと調べてみてもLuc2が分泌されるとか膜を透過できるとか謳い文句は見当たりません。

PMC4026177
doi: 10.1038/nmeth.2839
こちらの論文では、 D-Luciferin is also only modestly cell-permeable。。。としており、Luciferaseを発現する細胞の検出は可能であることを示していますが、さらに膜透過性のよいsynthetic luciferin, CycLuc1を使ってます。

ルシフェラーゼ、基質の細胞膜透過性 削除/引用
No.9892-1 - 2021/09/01 (水) 10:08:45 - ｚｚｚ
いつも勉強させていただいています。ルシフェラーゼと基質の細胞膜透過性について質問です。
トランスフェクション試薬の研究を行っていて、普段はin vitroでレポーターアッセイをGluc+セレンテラジンや、secNluc+bisセレンテラジンなどの、分泌型ルシフェラーゼ＋基質で行っています。
in vitroでのトランスフェクションが順調なのでマウスでin vivo レポーターアッセイをIVISを使って行うことを計画しています。
Luc2+Dルシフェリンの組み合わせでマウスに投与することを予定しています。
Luc2+Dルシフェリンがきちんと機能するか、事前にin-vitroで導入してIVISシステムでチェックしておこうと思っています。
そこで質問なのですが、Luc2のタンパク質は細胞膜透過性なのでしょうか？それとも基質のDルシフェリンが細胞膜透過性で細胞内に入るから発光するのでしょうか？ちなみにLuc2はプロメガ製品のほうのLuc2(pGL4 Vector)です。

JOVEで見つけたプロトコルに従ってin vitroでのチェックも行おうと思うので、実施自体は可能かと思うのですが、ルシフェラーゼ、基質の細胞膜透過性によって培養上清が発光するのか、細胞自体が発光するのか変わってくるかと疑問に思いまして。

ご教示お願いいたします。
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