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(無題) 削除/引用 No.9885-12 - 2021/08/29 (日) 07:26:30 - おお >SDS lysisの段階で蛋白質間相互作用はSDSの強い変性作用により失われるのでcoIPには適さない、てか事実上使えない。 じつはそんな壊滅的な状況でも入れる保険があるんですよ。 というわけではありませんが、Lysisする前にクロスリンク処理をしておけば、クロスリンクプロダクトとして結合を見ることができます。 また、お示しの方法はユビキチンがコバレントに結合しているかを示すためやChip assayにも使われています。IP効率とかは抗体次第です。場合によっては変性のためエピトープ部位が露出してフリーになり効率が良くなるかもしれません。SDS入のRIPA bufferでちゃんとワークする抗体なら通常のIPと遜色ないことも多いです。

(無題) 削除/引用 No.9885-11 - 2021/08/29 (日) 03:55:20 - r SDSはTX100とミセルを形成しその変性可溶化能が減弱することを利用した方法を書く この方法は一つの例に過ぎず原理的には同じようなもので様々なバリエーションがあるけど、抗体の室や抗原との親和性の強さとかエピトープにも大きく左右されるし成功率はどれもあまりぱっとしないです。とりあえずWBでなんか見えてくれれば、くらいの感じです。 １mlの1%SDS bufferで細胞溶解→超音波でDNAせん断（粘性がなくなればそれでいい。やりすぎない）→常温で遠心し不溶物除去（通常はほとんど何もないけど）→上清に10-20倍容量のIP用buffer(1%Triton X100含有）→必要ならばさらに適宜希釈→氷上で30分程度置く→遠心して不溶物除去（SDSの濃度低下で不溶化する蛋白質が時々あるので）→上清をIP試料とする。 DNAが邪魔で超音波だけではあれならDNase使用。 IPでは少なくともSDS濃度は0.1%以下にする 結構無理やりな方法なので回収率は高いくない。また原理からから分かるように、SDS lysisの段階で蛋白質間相互作用はSDSの強い変性作用により失われるのでcoIPには適さない、てか事実上使えない。 SDS濃度薄めても、TX100でSDSの作用を弱めても一旦崩壊したある程度のサイズの蛋白質の高次構造が完全に元に戻ることは期待できないので。

(無題) 削除/引用 No.9885-10 - 2021/08/28 (土) 18:38:26 - qq 質問の仕方が悪いんじゃなくて、これは一種の詩なのですよ。 きっと、、、誰にも何も聞いたりしていない（にちがいない）

(無題) 削除/引用 No.9885-9 - 2021/08/28 (土) 11:03:58 - み 質問の仕方が悪い。 状況を正確に説明しないと的確な答えが出てこない。 SDS含有バッファーを使用するとCo-IPされる率が低下しているという話だったら当たり前くらいにしか思わない。 SDSで分子間相互作用が解離してしまったらCo-IPされにくくなる。 total lysateではバンドがでているのなら抽出はされていて、抗体もworkしているということだろう。 SDSを入れないと細胞・組織から抽出されなければSDS含で頑張るか、フラクションを分取してmildなbufferで試すかな。 Tx-100、NP40、場合によればもっとmildな界面活性剤でやるのが第一選択。 でも0.1% SDSを含むようないわゆるRIPAでCo-IPが少しでも観察できるなら抗体量増やすか検出試薬の感度を上げても良い。

(無題) 削除/引用 No.9885-8 - 2021/08/28 (土) 07:30:13 - r 細胞からSDSで膜蛋白質を溶出して、それを試料としてipしてるということですか。（だとしたら、少し面倒な前処理しないとそのままではipかなり難しいです。単に希釈してsds濃度下げればいいじゃねとかの話ではありません。仮に処理してうまくいっても収率かなり低いです。なのでマイルドな界面活性剤のlysis bufferの方が良い結果だったというのは、わたしらからすると、まあ、そうだろうなと思います）IP前後のあたりの詳細希望。

(無題) 削除/引用 No.9885-7 - 2021/08/28 (土) 05:10:36 - おお Tritonのような界面活性剤でLysatesをつくってWBで検出するとバンドが確認できるのに、その抗体でIPしたときSDSサンプルバッファーで抽出したらWBで検出できなかったということですか？ Lysatesも結局SDSサンプルバッファーで処理しているわけですから、IPフラクションでSDSのせいで変になったというのはどの程度ありうるのかなと思います。ただしボイルなどでビーズにアグってついてしまったということは否定はできないですけど。SDSが気になるなら、ビーズから６M尿素で抽出して一応抽出物にサンプルバッファーをくわえてボイルせずに（尿素は３０度位を超えると蛋白と反応する）、流してみてもいいかもしれません。 しかしながら、そのIPでちゃんとものが落ちてきているのでしょうか？そのWBで検出しているタンパク質をその抗体でIPして、IPできているか見ているのですよね？そのばあい抗体がIPに向いてない可能性もありますし、その蛋白の結合パートナーの抗体でIPしているなら、実際結合しているものなのか、Lysatesにした状態で結合が外れてしまってないか、など他にも理由を考える必要があります。

(無題) 削除/引用 No.9885-6 - 2021/08/28 (土) 00:17:39 - mio >[Re:1] Barrさんは書きました : > WBで、膜タンパク質をSDSで可溶化するとバンド消失して、 ボイルはせずに、4度あるいはルームでオーバーナイトしてからウエスタンする、を試してみて。

(無題) 削除/引用 No.9885-5 - 2021/08/27 (金) 19:54:32 - Barr 説明不足でした。coIP後のSDS pageです。

(無題) 削除/引用 No.9885-4 - 2021/08/27 (金) 19:26:29 - おお >[Re:1] Barrさんは書きました : > マイナー膜タンパク質のWBで苦労しています。 > > いい抗体の候補が少なく、可溶化条件も手探りです。 > > WBで、膜タンパク質をSDSで可溶化するとバンド消失して、弱い界面活性剤だとバンドが見えるということはありうるのでしょうか？今使っているのは全長をターゲットにしたポリクロです。 > > これが本当ならどういう原理でしょうか？ > 色々考えられるのですが、細胞をLysisしたときSDSサンプルバッファーを使うか、そうでないかという事でしょうか？その場合SDSを使うと抽出されたタンパク量が多くそれに埋もれたり、泳動が理想的な状態ではなくなったりして検出感度を大きく損ねることがあります。 いずれにせよ > WBで、膜タンパク質をSDSで可溶化する、弱い界面活性剤 というのが具体的にどのような手順なのか曖昧です。弱い界面活性剤をつかってSDSは使わずにPAGEにロードしたのですか？膜タンパクを可溶化と言いますが、膜フラクションを集めて、膜タンパク質を回収したということなのですか？ また、すでに指摘がありますが、一部の膜タンパクは疎水性が強いためボイルをするとアグってしまい見当違いの非常に大きい分子サイズのところに流れたりすることがあります。まあそういうことがあるというなら、ボイルしたあと遠心したら沈殿していてロードする溶液の部分に目的のものがなかったとか言うのもある可能性も考えられますね。加えてSDSサンプルバッファー中の蛋白濃度が高すぎたとき、ボイルしたらほとんど蛋白が沈殿していたといったこともあります。流石にそういうときは目に見えて濁ったりするだろうから観察力が普通にあれば気がつくでしょうけど。

(無題) 削除/引用 No.9885-3 - 2021/08/27 (金) 19:00:59 - G25 膜タンパク質のように疎水ドメインを持つタンパク質は、 SDS存在下で加熱変性すると疎水結合でアグリゲートして、ゲルで分離しない（ゲルの網目を通っていかない）って話はよく聞くけれど。 SDS-PAGEサンプルバッファに調製するときの話ではなく、可溶化の条件だとすると、 やっぱりSDS存在下の疎水結合でアグリゲートして不溶化してるんじゃないでしょうか。弱い界面活性剤だとうまくミセルに埋め込まれて可溶化しているとか。 どういう可溶化条件をためしていますか？ 定番のRIPAなんかはまず最初にやってるのかな（SDSと非イオン性界面活性剤をミックスしてたように記憶する）。

(無題) 削除/引用 No.9885-2 - 2021/08/27 (金) 18:03:11 - あの 東洋紡のCan get signal使うと良いかも。 抗体は、かなり薄められます

WBで、膜タンパク質をSDSで可溶化するとバンド消失 削除/引用 No.9885-1 - 2021/08/27 (金) 17:52:28 - Barr マイナー膜タンパク質のWBで苦労しています。 いい抗体の候補が少なく、可溶化条件も手探りです。 WBで、膜タンパク質をSDSで可溶化するとバンド消失して、弱い界面活性剤だとバンドが見えるということはありうるのでしょうか？今使っているのは全長をターゲットにしたポリクロです。 これが本当ならどういう原理でしょうか？

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