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(無題) 削除/引用 No.9880-7 - 2021/08/27 (金) 00:20:38 - wertiu 遺伝子発現とmRNAレベルの量的調節（mRNAの安定性）とタンパク質レベルの量的調節（タンパク質の安定性）は、互いに協調して調節されているタンパク質も中にはありますが、多くはそれぞれのレベルで独立に行われているので、必ずしもmRNAレベルとタンパク質レベルはパラレルではないのはおかしなことではありません。合成されてから数秒で分解されるタンパク質もありますし、逆に一旦作られたら半減期が数日に渡るものもあります。O/Eは極端な量になるので本来当該蛋白質が受けるであろう生理的な分解機構で制御できるかどうかわからないので、0/Eが染まるのにーーーendoは　というのは一概に言えないかもしれません。 proteasome inhibitorやautophagy阻害剤で細胞を一定時間処理した時に、検出できるようになればそういう（半減期の短いタンパク質である）可能性もあります。 実験上の原因としては、単に今の実験条件では抗体の検出感度の関係で、量的に少ないかもしれない内在性の当該蛋白質をdetectできないだけかもしれません。O/Eは量的にendoよりはるかに多いし感度悪くてもdetectできるけどみたいな。　 この場合は（もしPFA固定ならば）固定条件（時間の短縮（数分以内）の検討　(培養細胞は特に固定が長いと影響大きいです）、抗体濃度や反応時間のup、蛍光標識の変更などで改善できると思われます。

(無題) 削除/引用 No.9880-6 - 2021/08/26 (木) 20:11:02 - そば 翻訳が阻害されていると、メッセージレベルではネガコンよりたくさんあるのに タンパクレベルではネガコンより少なくなる、という論文を見た覚えがあります 確かmiRNA の論文でした。 一応そういう現象もあるかもよっていうご参考程度にどうぞ。

(無題) 削除/引用 No.9880-5 - 2021/08/26 (木) 11:25:08 - seventh 発現の有無レベルならともかくタンパク質量の大小は免染ではわからない場合も多いです。今回はネガコンとしている未刺激のものでも染まっているので、露光条件などを調整すれば差が見えるかもしれません。（当然ですが染色・露光条件は刺激、未刺激でそろえないと比較自体が無意味です） 定量という意味ではどうせWBのデータが必要になるので、先にWBでタンパク質レベルでも差があるか確認した方が良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.9880-2 - 2021/08/25 (水) 23:58:07 - おお >�AmRNAからたんぱく質が作られていない >�Bタンパクが即座に分解されることはあまり現実的ではないのかなと思っています 両方ともそのような例は報告があると思います。�BはHIF1とか。 染色についてはよくわかりませんがOEで染まっているわけですよね。使えているのにと思ってしまいますが、、、たしかにOEよりEndoを見るほうが難しいとは言えますが、やりようがあるかもしれないと思ってしまうのです。 WBもして考察するべきかと思いますが。そうしないと結論を導き出すのが難しそうです。

mRNAは高値だが蛋白質が発現していない？ 削除/引用 No.9880-1 - 2021/08/25 (水) 20:44:51 - ちょこ あるイヌ細胞を刺激すると、目的タンパク質のmRNAの発現量が高値だったため、イヌ細胞を刺激して蛍光免疫染色を行いました。 しかし、刺激した細胞と刺激していない細胞の蛍光免疫染色に差はみられませんでした。（どちらも光っている） 蛍光免疫染色に使用したイヌモノクローナル抗体は当ラボで作製したもので、目的タンパク質をトランスフェクションして発現させた細胞では染色が確認できています（トランスフェクションしていない細胞は陰性でした）。 ちなみに、ヒト細胞にヒトモノクローナル抗体（市販）で刺激した実験では目的タンパク質は刺激した場合のみに染色されました。 この結果から、考えられることは以下であると思っています。 �@抗体が細胞の目的たんぱく質以外にに非特異的に結合してしまっている �AmRNAからたんぱく質が作られていない �Bたんぱく質が合成後に即座に分解されている（刺激は24時間して細胞固定しています） これらについて、私の結論は以下のとおりなのですが、これら分野に詳しい方がいらっしゃいましたら、ご助言いただけますと大変助かります。 �@の場合は、このモノクローナル抗体は使えないのかなあ・・・と思っています。 �AmRNAからタンパクが作られない理由としては、培地が不適ということが考えられるのでしょうか。 �Bタンパクが即座に分解されることはあまり現実的ではないのかなと思っていますが、ご存知の方いらっしゃいましたら教えていただけませんでしょうか。 よろしくお願い申し上げます。

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