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(無題) 削除/引用 No.9847-7 - 2021/08/12 (木) 22:09:29 - スノーク pUC oriは30℃で培養すると37℃よりコピー数が下がるはずなのに収量が上がるということは、そのプラスミドが大腸菌に嫌われているということでしょうね。 前回と今回で違っている条件が何なのかはネット越しには判断のしようがないので、試せることとしてはおおさんがおっしゃるようにホスト株を変えてみるくらいでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.9847-6 - 2021/08/12 (木) 15:15:58 - おお >やはりウイルスベクター は不安定でStb系でやった方が良いのかもしれないのですが、やはり他のベクターがよく増えてて、かつ同じベクターが半年前もよく増えてるという事が説明できないと思います。 あまり確かな理屈はないのですよ。Stb系でなくてもそれでも行き詰まったときStb系でなくても変えてみたらうまく行ったという話はちょくちょく聞くのです。 生えたコロニーを念の為もう一度プレート上にストリークしてそこからシングルコロニーを拾ってみてもいいかもしれません。 ＞ラボの先輩に30度培養をしてみたらと言われたので昨日やってみたのですが、収量は倍ぐらいに上昇した感じになります（それでも半年前の半分以下なのですが）。 もし３０度で培養するなら、大腸菌を回収する１時間前ぐらいに３７度に上げるといいかもしれません。

oyajiさんありがとうございます 削除/引用 No.9847-5 - 2021/08/12 (木) 14:08:24 - LL Ampicilinの線は確かに古くなったかもしれないという事で考えたのですが、それだと同時期に他のベクターが増えが良いのが説明できないので否定してしまいました。 もう一度全てのAmpicilinを変えてみるのもありですね。

おおさん　ありがとうございます 削除/引用 No.9847-4 - 2021/08/12 (木) 14:05:47 - LL 実験条件は全くもって一緒でした。 今回はさらにtransformationした大腸菌のコロニーを拾い、新しいプレートに継代しPCRをかけて、入っている事を確認した後に液体培養したのですが、やはり収量が低いままでした。 ラボの先輩に30度培養をしてみたらと言われたので昨日やってみたのですが、収量は倍ぐらいに上昇した感じになります（それでも半年前の半分以下なのですが）。 やはりウイルスベクター は不安定でStb系でやった方が良いのかもしれないのですが、やはり他のベクターがよく増えてて、かつ同じベクターが半年前もよく増えてるという事が説明できないと思います。 いろいろ考えて半年前は冬で今は夏だからなのかもしれないなどと考え出したのですが、違うと言ったら湿度ぐらいで、逆に今の季節の方が増えが良いはずなので説明もつかなく迷宮入りです（笑）

抗生剤 削除/引用 No.9847-3 - 2021/08/12 (木) 13:23:17 - oyaji アンピシリンは不安定。濃度を調整すると良いこともあります。 長すぎるインキュベーションは、経験上、ダメです。 シングルコロニーを拾います。

(無題) 削除/引用 No.9847-2 - 2021/08/12 (木) 08:29:29 - おお まえうまく行ったときと全く一緒でしたか？ いくらか配列が反復されている部分があるプラスミドなのでStbl系のコンピ使ってみたらどうでしょうか（これがだめであれはOKという絶対的なものではないですけど、そう言うので解消されたりすることもあったりする）？Stbl系がないならなにかDH5a以外のコンピで試してみてもいいでしょう。 あとはTransformationのときにヒートショックを３７度ぐらいでやるとか言うのもたまに解決方法で聞くことがあります。

形質転換後のプラスミド収量が少ない 削除/引用 No.9847-1 - 2021/08/10 (火) 13:04:57 - LL 皆様こんにちは。 最近融合タンパクを過剰発現するベクターの作成に取り掛かっておりまして、SigmaのSHC203ベクターを色々弄って実験を行おうと計画しております。 その第一歩としてこのベクターをニッポンジーンのDH5aに形質転換し、Ampicilin添加のLB液体培養で増やしたのちプラスミドを精製しようとしています。しかし、形質転換後のコロニーは普通に形成され、液体培養も培養液は混濁するのですが、最後にMIniprepで精製するとプラスミドの収量がとにかく低いです。 （例：同体積に溶かした際、Takara plvsinやSigmaに発注したカスタムsiRNAのプラスミドが500ng/ulなのに対し、SHC203では50ng/ul） 低いですがある程度あるので、それをLigationに使用してみたのですが、上手くいかず、変な形のコロニーが 形成され、目標のプラスミドは得られなかったので、Ligationに使用したベクター液のSHC203純度が足りないと分析し、純度を高めようと先輩が増やしたプラスミド液ではなく原液を使って形質転換した所、結果は変わりませんでした。 以前このベクターを単なるレンチのコントロールとして使用していた時は先輩からもらった液でも2.5mlスケールの液体培養で200〜300ng/ulの濃度はだせていました。 特に実験条件に変化もないのに収量が落ちてしまい、２週間考えた結果行き詰まってしまったので、皆様の知恵を借りたく質問させて頂きました。 どうぞよろしくお願い致します。

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