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(無題) 削除/引用 No.9843-20 - 2021/08/13 (金) 06:00:44 - TT ii様 （純水でしたね。）ありがとうございます。機会がありましたらやってみます。

(無題) 削除/引用 No.9843-19 - 2021/08/13 (金) 05:59:30 - TT >[Re:17] 人さんは書きました : > 血球計算盤で数えるときに白血球(リンパ球)と赤血球の区別がつくかどうかですが、 > 経験上は顕微鏡の性能に左右されると感じています。 > > 両者の大きさは以外と似たような感じですが、 > 顕微鏡の解像度などが良好な場合には、白血球は膜が厚くしっかり見えます。 > 赤血球は膜が薄いのと、おへそが見えます。 > 赤血球のおへそはピントを少し変えながら見ると見やすくなります。 人様 観察のコツを教えていただきありがとうございます。次回カウントするときに注意してみます。

(無題) 削除/引用 No.9843-18 - 2021/08/13 (金) 00:35:02 - ii >血球細胞回収後、1xHBSSで（例えば）1mLでリサス、18mLの氷冷純粋を加えてミックス、20秒おいて溶血、10xHBSSを１mLを加えてトータル20mLで等張に戻す そうです。

(無題) 削除/引用 No.9843-17 - 2021/08/12 (木) 14:10:34 - 人 血球計算盤で数えるときに白血球(リンパ球)と赤血球の区別がつくかどうかですが、 経験上は顕微鏡の性能に左右されると感じています。 両者の大きさは以外と似たような感じですが、 顕微鏡の解像度などが良好な場合には、白血球は膜が厚くしっかり見えます。 赤血球は膜が薄いのと、おへそが見えます。 赤血球のおへそはピントを少し変えながら見ると見やすくなります。 もしかすると位相差顕微鏡のほうが見えやすい場合があるかもしれません。 また、赤血球の鑑別の是非は種によっても違うかもしれません。 たとえばアカゲザルの赤血球のおへそはよく見えるけど カニクイザルの赤血球のおへそは見えづらい、という説があります。

(無題) 削除/引用 No.9843-16 - 2021/08/12 (木) 00:34:08 - TT >[Re:14] iiさんは書きました : > Percollの密度勾配で好中球を赤血球が混じった状態で回収、HBSSのサスペンションにした後、18倍量の氷冷の純水を加えて20秒置いて溶血、10xの HBSSを加えて等張に戻し、好中球より少し軽いPercollで好中球だけペレットにして回収、ということをやったことが有る。 ii様 血球細胞回収後、1xHBSSで（例えば）1mLでリサス、18mLの氷冷純粋を加えてミックス、20秒おいて溶血、10xHBSSを１mLを加えてトータル20mLで等張に戻す、 このような手順でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9843-15 - 2021/08/12 (木) 00:21:21 - TT ななし様 ありがとうございます。やはり分離作業時の血液状態が重要なようですね。ご使用されている溶液やチューブも紹介していただきありがとうございました。参考にさせていただきます。

(無題) 削除/引用 No.9843-14 - 2021/08/11 (水) 21:29:00 - ii Percollの密度勾配で好中球を赤血球が混じった状態で回収、HBSSのサスペンションにした後、18倍量の氷冷の純水を加えて20秒置いて溶血、10xの HBSSを加えて等張に戻し、好中球より少し軽いPercollで好中球だけペレットにして回収、ということをやったことが有る。

(無題) 削除/引用 No.9843-13 - 2021/08/11 (水) 15:11:45 - ななし > ちなみに採血管は何を使いますか？希釈は通常のPBSでやります？HBSS使ったことありますか？ 採血管は普通のヘパリン管です。希釈はPBSです。HBSSでは希釈したことがありません。 分離にはLymphoprep tubeを使っています。 https://www.cosmobio.co.jp/product/detail/00730008.asp?entry_id=1810#LymphoprepTube Sepmateでも良好に分離できた経験があります。 https://www.veritastk.co.jp/sciencelibrary/pickup/sepmate.html ご参考までに。

(無題) 削除/引用 No.9843-12 - 2021/08/11 (水) 00:26:24 - TT 人様 >[Re:9] 人さんは書きました : > こんにちは。 こんにちは！詳細な解説ありがとうございます。 > Ficoll法により回収したPBMCを血球計算盤で確認し、白血球100個に対し赤血球10個にまで純化できたとします。 血球計算盤で数えるときにPBMCとRBCの区別つきますか？（これもいつも疑問でした。） > これほどの高効率にもかかわらず赤血球が多少のこってしまうのは、ひとえに元々の赤血球数が多すぎるからと言い得ると思います。別のいいかたをしますと、普通にやっていて赤血球の混入がゼロになることはない、といえるのではないでしょうか。 ですよね。。。。やはり多少は混ざってしまうのはいたしかたないですよね。 > 赤血球を溶解するバッファー RBC Lysis Buffer > https://www.funakoshi.co.jp/contents/68079 > > RBC Lysis Buffer 10x > https://www.biolegend.com/ja-jp/products/rbc-lysis-buffer-10x-1498?GroupID=BLG2181 > リンクありがとうございます。参照させていただきます。

(無題) 削除/引用 No.9843-11 - 2021/08/11 (水) 00:18:59 - TT ななし様 ありがとうございます。 >[Re:8] ななしさんは書きました : > 原因不明ですが、どうしても赤血球が混ざる検体はどうしてもあります。 やはり血液状態に左右されますね。 > もし当日中に分離できない場合は室温でローテーションしながら保管し、翌日すぐに分離します。 > 静置したままだとコンディションが悪くなるので注意が必要です。 確かに静止状態ですと固まりやすい？のかもしれないですね。当方も時間があくときはシェイカーで揺らしています。 ちなみに採血管は何を使いますか？希釈は通常のPBSでやります？HBSS使ったことありますか？

(無題) 削除/引用 No.9843-10 - 2021/08/10 (火) 15:26:55 - 人 すみません。単位が不完全でしたので、白血球数、赤血球数について、個/μlに訂正いたします。

(無題) 削除/引用 No.9843-9 - 2021/08/10 (火) 09:45:20 - 人 こんにちは。 Ficoll法により赤血球の除去率を100%にする方法は分からないのでお伝えできませんが、 御自身の手技による赤血球の除去率をイメージしていただくことは有益かもしれません。 もともと、末梢血の中の白血球は5,000個程度であり、赤血球数は5,000,000 (500万)個程度であるとしてみます。そうすると、赤血球は白血球の1,000倍の数存在することになります。 Ficoll法により回収したPBMCを血球計算盤で確認し、白血球100個に対し赤血球10個にまで純化できたとします。この場合、赤血球の比率は 10,000 (1万)分の1まで減らせたということができます。また、このときの純化の効率(赤血球除去率)は99.99%と表現することも可能です。 これほどの高効率にもかかわらず赤血球が多少のこってしまうのは、ひとえに元々の赤血球数が多すぎるからと言い得ると思います。別のいいかたをしますと、普通にやっていて赤血球の混入がゼロになることはない、といえるのではないでしょうか。 したがい、赤血球の混入をさらに減らす必要がありましたら、あの様のご示唆のように、溶血用試薬で処理なさるのがよろしいと思います(100%溶血できるかどうかは確認しておりません)。 一般的には"ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) lysis buffer"というのが使われます。ググれば相当量の情報がみつかるかと思います。ほかに以下のような製品もあります。 赤血球を溶解するバッファー RBC Lysis Buffer https://www.funakoshi.co.jp/contents/68079 RBC Lysis Buffer 10x https://www.biolegend.com/ja-jp/products/rbc-lysis-buffer-10x-1498?GroupID=BLG2181

(無題) 削除/引用 No.9843-8 - 2021/08/10 (火) 09:31:53 - ななし キレイに分離するかどうかは採血からの時間と温度が重要です。 時間の経った血液はかなりの確率で赤血球が残ります。 また何かの手違いで冷蔵された血液も同様に赤血球が残ります。 当研究室では当日中の分離がデフォルトです。 8割方キレイに分離できます。 原因不明ですが、どうしても赤血球が混ざる検体はどうしてもあります。 もし当日中に分離できない場合は室温でローテーションしながら保管し、翌日すぐに分離します。 静置したままだとコンディションが悪くなるので注意が必要です。

(無題) 削除/引用 No.9843-7 - 2021/08/10 (火) 06:39:32 - TT あの様 探していただいてありがとうございます。分離後の細胞の回収方法についてですね。この当時はFicollの上に直接血液をのせて遠心分離をしていたと思います。その後の、チューブの中にできた細胞層の回収方法についてですので、私の知りたいこととは少しずれているように思います。お手間をとっていただきありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.9843-6 - 2021/08/10 (火) 04:31:53 - あの 過去スレのこれとか参考になりますか？ http://kenkyuu2.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?mode=view;Code=245

(無題) 削除/引用 No.9843-5 - 2021/08/10 (火) 00:28:41 - TT むしろ「普通にやってて赤血球が混ざることなんてないよ」という方はいらっしゃいますか？

(無題) 削除/引用 No.9843-4 - 2021/08/10 (火) 00:23:34 - TT >[Re:3] TTさんは書きました : > >[Re:2] あのさんは書きました : > > レスつかないようなので。 > ということは多少赤血球が混ざることはしばしばあることなのだな、ととらえております。自分のやり方がそれほど間違っているわけではないんだな、と受け止めております。 やっぱり採血される人の健康状態や採血の方法、フレッシュさ等、血液状態に大きく左右されるということですかね.....

(無題) 削除/引用 No.9843-3 - 2021/08/10 (火) 00:14:34 - TT >[Re:2] あのさんは書きました : > レスつかないようなので。 ということは多少赤血球が混ざることはしばしばあることなのだな、ととらえております。自分のやり方がそれほど間違っているわけではないんだな、と受け止めております。 > 20年以上前に、普通のヘパリン真空採血管で、バフィコートとってたときは、 > たしか > 　遠心分離して血漿除去 > 　低調液入れて赤血球を破裂させ > 　遠心して、なんらかのバッファで洗い、遠心して > 　白血球の沈殿を回収 これはFicollバッファーの比重遠心をやらない場合ということでしょうか。昔はこのように取っていたのですね。

(無題) 削除/引用 No.9843-2 - 2021/08/09 (月) 20:27:35 - あの レスつかないようなので。 20年以上前に、普通のヘパリン真空採血管で、バフィコートとってたときは、 たしか 　遠心分離して血漿除去 　低調液入れて赤血球を破裂させ 　遠心して、なんらかのバッファで洗い、遠心して 　白血球の沈殿を回収 低調液のレシピは忘れたけど、たぶんネットとか本で探せる。

PBMC、Buffy coatのきれいな層を作るコツ 削除/引用 No.9843-1 - 2021/08/07 (土) 03:03:12 - TT いつも参考にさせていただいております。 ヒト全血からFicollでPBMCを抽出しております。プロトコールはごく一般的な方法です。Leucosep tube等を用いて、全血をPBSで２倍希釈し、遠心にかけてバッフィーコートを回収、という手順です。 概ねうまく分離はできているのですが、どうしても赤血球が多少混ざります。バッフィーコートの下にごく薄く赤血球層がうっすらとあります。Leucosepのフィルター上にも落ちなかった赤血球が少々残っています。 一応は許容範囲なのではあるのですが、できれば広告にあるようなクリアーな層を毎回作ることができればなぁと常々思っております。みなさんが普段心がけているような、コツのようなものがあるでしょうか？ 採血管はEDTAラベンダーかHeparin緑をよく使います。 分離作業は採血当日ではなく次の日にすることがあります。ただし、24時間以上は置かないようにしています。 分離バッファーは常温のものを使っています。遠心も常温で、念の為アクセルはスロー、ブレーキはオフでしています。 遠心はスイングローター、バケットは4つで、4つとも同じ重さですべてのバランスを取っています。 希釈はDPBSを使っているのですが、PBSのほうがいいとか、希釈をもっとしたほうがいい、希釈しないほうがいいとかあるのでしょうか？PBSではなくてHankバッファーのほうがいいと聞いたこともあるのですが、そういうこともあるのでしょうか？ よろしくおねがいします

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