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(無題) 削除/引用 No.9842-13 - 2021/08/10 (火) 04:56:02 - おお >[Re:11] 大根さんは書きました : > 書き忘れていましたが、乾燥したメンブレンはところどころ白くなりますが、全体的にメンブレンの色が不均一です。（透明に薄くなったところ、白くなったところなど） > 特に白くなったところが、真っ黒になります。 > 抗体のバンドは普通に出ていました。 中途半端に乾いているのが悪影響を与えやすいのかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.9842-12 - 2021/08/07 (土) 17:14:20 - western うちらは自慢できることではないですがWesternはあまり細かいこと気にせずなんとなくやってる感じだけど、そういう感じのトラブルはないので手技的なこととかでなく試薬や装置、抗体などに系統的な問題があるように思う。とりあえず書く。 小さい点状の汚れは多分微細なゴミに、たまたまそれに反応しやすい抗体がくっつくことがある。プレキャストでもどこまでケアして作成してるかわからないので起こりうる。一度、APSとTEMED入れる前にゲル溶液を0.22μmフィルターとして、ゲル板に流し込んでみる。Running bufferも　メタノール入れる前に培地類を濾過滅菌するようなボトルタイプのフィルター通してから使用してみる。 基本的に水は超純水を使用する。 転写後の膜はblockingする前に、十分な量の水またはPBS or TBSなどで10~30分程度、１、２回液を交換しながら静かに洗う。昔、Backgroundが高いor汚い時の対処法としてメーカーの人に教えてもらった。抗体にもよるので一概に言えないかもしれないけど、見せてもらったデータは、する・しないでBGの綺麗さが確かに全然違った。抗原量が豊富で短時間の露光でシグナルが得られるような場合は気がつかないけど、抗原が少なくて露光時間が長くなると目立ってくるらしい。 転写後は乾燥させない。もし乾燥させるなら完全かつ均一に乾燥させる。中途半端に乾燥させてしまうと大変残念な結果になる。 転写装置のカセットやスポンジが変形、劣化して密着が不完全になり、転写中に蛋白質が変な感じで膜とゲルの間に拡散したりしているかもしれない。セミドライでも電極板の変形や電場の不均一化がでてくることがある。蛋白質染色で転写や染まり方の不均一さが感じられるなら可能性がある。wetでもsemidryでも使用頻度が高い装置では年単位で使ってるとどうしてもだんだん変になる。必要ならばメーカーに依頼して装置の点検をするといい。 PVDF膜が不良lotなのかもしれないので、新しく別ロットを買い直す。

(無題) 削除/引用 No.9842-11 - 2021/08/07 (土) 10:20:59 - 大根 書き忘れていましたが、乾燥したメンブレンはところどころ白くなりますが、全体的にメンブレンの色が不均一です。（透明に薄くなったところ、白くなったところなど） 特に白くなったところが、真っ黒になります。 抗体のバンドは普通に出ていました。

(無題) 削除/引用 No.9842-10 - 2021/08/07 (土) 10:17:39 - 大根 おお様 回答ありがとうございます。 メタノールは試薬特級です。 同時に2枚転写したうちの1枚はうまくいっているのと、「乾燥したらぱーになる」とどこかのブログに記載があったので、バッファーの問題ではなく、メンブレンの感想の問題のような気がしています。 確かに、乾燥のようなものは転写直後のメンブレンではみられません。 その後、急速に乾燥してこのような症状がでます。 わざと乾燥させる方法がどのようなものか存じ上げないのですが、一般的にはメンブレンを乾燥させると抗体反応後に黒い点ができてしまうそうで今回の症状に当てはまります。 https://www.abcam.co.jp/blog/index.cfm/2010/12/20/-WesternBlot- 乾燥スピードがメンブレンによって違う気もするのですが、ひとまず試してみて進展がありましたらご報告させていただきます。

(無題) 削除/引用 No.9842-9 - 2021/08/07 (土) 01:14:23 - おお 乾燥したPVDFは溶液がアクセスできないので抗体が付くことができず、バックグランドすら見れないようです。わざと乾燥させて、バックグランドが出ない状態でWBする方法も考案されています。蛋白が結合しているところは水親性になっているのでその部分にだけ抗体がアクセスできるという原理に基づいています。 しかしところどころ白い（乾燥している？）のは変なのでメタノールに一度つけたほうがいいのかもしれません。ただ白くないところもあるのですよね、、、その部分はうまくいっていてもおかしくないだろうに、、、 しかしTransfer中にそれが起こるとすると、再度メタノールにつけることが解決策になるだろーか、、、 メタノールはどんなグレードのものを使ってますか？

(無題) 削除/引用 No.9842-8 - 2021/08/07 (土) 00:28:06 - 大根 み様 改善方法までありがとうございます。 確かに乾燥したメンブレンはポンソーをはじいていた印象がありました。 解決とさせていただきます。

(無題) 削除/引用 No.9842-7 - 2021/08/07 (土) 00:19:42 - み 乾燥した場合、再度メタノールに30秒入れた後、TBSTに平衡化し、ブロッキング液に入れたら問題ない。

(無題) 削除/引用 No.9842-6 - 2021/08/06 (金) 23:17:23 - 大根 み様 確かにその可能性はあります。 マーカーが転写されたかどうか、じっくり見てしまったときに100％エタノールのように乾燥していったような記憶があります。 今度は気を付けてみようかと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9842-5 - 2021/08/06 (金) 23:13:51 - み 転写後にメンブレンを直ちにバッファーに入れないと乾燥します。乾燥したところは白くなり、乾燥してない部分は透明っぽくなるかな。 まばらになって抗体の当たり方が非特異に起こるとか？

(無題) 削除/引用 No.9842-4 - 2021/08/06 (金) 22:18:57 - 大根 もう一つ心当たりがあるとすると、最近、メンブレンとゲルの間に気泡が入るのを防ぐため、ヘラで気泡を取っていますが、だんだん強く押さえてしまっているような気がします。 関係ありますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9842-3 - 2021/08/06 (金) 21:47:19 - 大根 ああああああ様 ゲルに問題があるということでしょうか。 わずかであれば問題なかったのですが、全体的にポツポツとなり、真っ黒になってしまうので、改善方法があればと思うのですが、、、 確かに、論文でもわずかにポツが存在するブロットの写真は見たことがあります。 追記ですが、ポツポツが発生したメンブレンでは、タンパク質を流したレーンを転写したメンブレンの色が他の場所より薄く（透明に近い）なります。

(無題) 削除/引用 No.9842-2 - 2021/08/06 (金) 21:36:52 - ああああああ トランスファーの後、PVDFメンブレンを見てみると、ガサガサと乾燥したような感じ（白いポツポツ ↑これはゲルかなと思っています(調べたことはありません)。私も時々見ますが、小さいものであれば気にせずに進行しています。

ウエスタンブロットの酷いバックグラウンド 削除/引用 No.9842-1 - 2021/08/06 (金) 21:00:40 - 大根 いつもお世話になっております。 ウエスタンブロットでタンパク質の検出を試みているのですがバックグラウンドが酷く、困っております。 Bioradのタンク式の標準プロトコル、自作ゲルで行っております。 トランスファーの後、PVDFメンブレンを見てみると、ガサガサと乾燥したような感じ（白いポツポツ？）になってしまいます。 このせいか、メンブレンが真っ黒になってしまいます。 ポンソーで染色してみると、タンパク質染色されるので気泡とかではないようです（気泡なら白く抜けるはずですし）。 しかし、メンブレン自体の色が場所によって暗かったり明るかったりと、おかしいです。 PVDFメンブレンを親水処理した後ではこのようなガサガサにはなっていないこと、以前、プレキャストゲルで行ったときにも同様の現象が起きたため、トランスファーに原因があると疑っています。 以前は、転写バッファー（25 mM トリス、192 mM、10%メタノール）を再度調製しなおしたら改善しました。 今回は改善せず、また2枚同時に転写した1枚だけがこのようになってしまい、どこに原因があるのか分からずにいます。 トリス、グリシンが3-4年前のものですので、それも原因かと思いましたが、1枚だけがおかしい状況ですので、試薬類を一新しようとは思いますが、他の問題もあるかと思います。 ご経験のある方、お教えいただけますと幸いです。

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