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タンパク質の酸化を防ぐ トピック削除
No.9837-TOPIC - 2021/08/05 (木) 16:35:26 - あかね
リコンビナントタンパク質の酸化による重合を阻止したいと思っており、アドバイスをいただければ幸いです。

ちょっと、話がややこしいです。
大腸菌より調整した2種類のタンパク質AとBをSpyTag/SpyCatcherの系を使ってドッキングさせてA+Bを調整しました。(ちなみに、SpyTag/SpyCatcherは分子間共有結合を誘導するシステムです）
Bは酵素活性をもつタンパク質で、その活性には分子内システイン間のSS結合が必要です。今回は、大腸菌の封入体からリフォールディングし、その過程で酸化型・還元型グルタチオンを使って分子内SS結合の形成をおこなっています。(酵素活性確認済み）
大腸菌から精製したタンパクAとBを混ぜるとABの最終産物が出来上がるのですが、それを４℃で数日置くとABがSS結合を介した重合体に変化してしまいます。(ABを還元、非還元の状態でSDS-PAGE解析すると非還元状態でのみ重合した高分子バンド(ほとんどが２量体）が確認されます)。おそらく空気酸化？タンパク質B単独では４℃保存で多量体化しないことから、タンパク質Aに存在するシステインによって２量体化していると考えられます。

そこで、タンパク質ABの酸化を防ぎたいのですが、Bの酵素活性（分子内SS結合に依存）をキープしたいので、積極的にDTTなどの還元剤を入れたくないのです。

前置きが長くなりましたが、お聞きしたいのは、
@既存のSS結合を切断することなく、酸化防止することができる方法はないか？EDTAとか？窒素置換？
Aあるいは、低温状態（最終的には50%Glycerol入れて-20℃保存します）で微量の還元剤(1mM DTTくらい？）を入れておけば、Bの活性を維持したまま、酸化防止の効果が見込めるのではないかとも妄想しています。一般論でも構いませんので、「タンパク質内SSは低温状態だと還元されにくい」、という、私を勇気づける、あるいは打ちのめすコメントなどウェルカムです。

なんだか自己完結しているような質問になっていますが、どんなアイディアでも良いですので、よろしくお願いします。
　
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(無題) 削除/引用
No.9837-8 - 2021/08/17 (火) 04:30:39 - おお
時間が立ってしまいましたが、抗酸化剤、たとえばアスコルビン酸、Vitamin Eとか食品に使う抗酸化剤BHT（日本では許可がでてないかも）などはどうかと思っています。具体的な例は見つけそこねていますので書こうかどうか迷ってはいましたけど。あとこれはほんとに効くかどうかわかりませんけど還元糖とか、、、グルコースやソルビトールなどですね。いちおう抗酸化に着目した論文はあるようですが。

あと溶液のpHでもS-Hの反応性が変わりそうではあります。S-Hの水素はアルカリがわで電離する傾向にありますので。そうすると電子が奪われやすいのではと思いますが、これもあまり直接的な記述は見つけられていません。pKaは８強のようですからできれば弱酸性に振っておけばいいのかもしれません。
https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/acs.jpcb.5b10093

もう少し具体的な話ができればよかったのですが可能性ということで書かせていただきました・

(無題) 削除/引用
No.9837-7 - 2021/08/06 (金) 13:24:52 - あかね
SYBER masterさん
コメントありがとうございます。
確かに、脱気しておくと、溶存酸素が低くなって酸化防止できるかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.9837-6 - 2021/08/06 (金) 11:08:34 - SYBR master
試薬類、特にbuffer類の脱気は効果無いですかね？

使用直前に脱気するために、同僚が毎朝、真空ポンプ回して脱気していたの覚えています。

(無題) 削除/引用
No.9837-5 - 2021/08/06 (金) 10:26:21 - あかね
みなさん、ややこしい文章を読んでいただき、コメントありがとうございます。

>totoさん、
なるほど、DTTあるいはGSH・GSSGに関するコメントありがとうございます！

>あのさん、
脱酸素剤ですね。保存する際の安心保証として良いかもしれませんね。調べてみます。
ありがとうございます。


>おおさん
コメントありがとうございます。SH基の保護というアイディアは考えていませんでした。ありがとうございます。ただ、今回はタンパク質の機能維持という点で、採用は難しいです。
ちなみに、(私の文章が分かりにくかったですが）SpyTag/SpyCatcherが共有結合後に、再解離しているわけではないです。ありがとございます。

(無題) 削除/引用
No.9837-4 - 2021/08/06 (金) 03:07:08 - おお
SpyTag/SpyCatcherで共有結合させたのに、それがはずれるってどういうことかなぁとおもいました。SpyTag/SpyCatcherがワークしてないということなのでしょうか。それでもヘテロダイマーができるなら必要ない？

タンパクAをN-Ethylmaleimide (NEM) でしょりしてSH基を保護するという手はあると思います。SHをターゲットにしたアルキル化剤のたぐいですが蛋白にどれくらい影響があるかは使うタンパク質次第でしょう。

その他にもSHを保護できる試薬はあるようですから、いくらか試してもいいかもしれません。
https://www.researchgate.net/figure/Structures-of-commonly-used-alkylating-reagents-and-cysteine-alkylation-products_tbl1_232738571
Iodoacetamideも昔からこの手の手法でよく使われているかな。

あとすでに指摘がありますが金属イオンは酸化の原因になりますのでEDTAはある程度酸化防止に聞くかもしれません。例えば１００ｕMほどのCuイオンがあると近くにあるSH基同士をS-Sに変えてしまうのでそれを利用して蛋白をクロスリンクすることがあります。ただ、EDTAで長期的にというと、、、私はよくわかりません。

(無題) 削除/引用
No.9837-3 - 2021/08/05 (木) 20:17:58 - あの
求める酸化防止のレベルにもよりますが、当方では

　脱酸素剤を同封して、
　食品を真空パッケージする装置を使う

ということしたりします。

他の人は、次のことしてる人いますが、
(当方ではやめました。)
　ガラスチューブに入れて逆さにして、
　下から窒素ガス吹き込んで、
　空気を置換したと思えたら、キャップして
　シールテープでシールする
　
まあ両方ともやるのが一番かもしれませんが。

(無題) 削除/引用
No.9837-2 - 2021/08/05 (木) 18:32:50 - toto
ETDAが有効なときもたまにありますし、窒素置換は本来はいいですが、少量の蛋白溶液の場合はしっかりやるのが難しいかもしれません。1mM DTTを加えると低温でも切れやすいS-Sは切れてしまいます。
S-Sかけるときに用いられたredox bufferのまま保存しておけばどうでしょうか。GSHとGSSGの比は１：１くらいですよね。

タンパク質の酸化を防ぐ 削除/引用
No.9837-1 - 2021/08/05 (木) 16:35:26 - あかね
リコンビナントタンパク質の酸化による重合を阻止したいと思っており、アドバイスをいただければ幸いです。

ちょっと、話がややこしいです。
大腸菌より調整した2種類のタンパク質AとBをSpyTag/SpyCatcherの系を使ってドッキングさせてA+Bを調整しました。(ちなみに、SpyTag/SpyCatcherは分子間共有結合を誘導するシステムです）
Bは酵素活性をもつタンパク質で、その活性には分子内システイン間のSS結合が必要です。今回は、大腸菌の封入体からリフォールディングし、その過程で酸化型・還元型グルタチオンを使って分子内SS結合の形成をおこなっています。(酵素活性確認済み）
大腸菌から精製したタンパクAとBを混ぜるとABの最終産物が出来上がるのですが、それを４℃で数日置くとABがSS結合を介した重合体に変化してしまいます。(ABを還元、非還元の状態でSDS-PAGE解析すると非還元状態でのみ重合した高分子バンド(ほとんどが２量体）が確認されます)。おそらく空気酸化？タンパク質B単独では４℃保存で多量体化しないことから、タンパク質Aに存在するシステインによって２量体化していると考えられます。

そこで、タンパク質ABの酸化を防ぎたいのですが、Bの酵素活性（分子内SS結合に依存）をキープしたいので、積極的にDTTなどの還元剤を入れたくないのです。

前置きが長くなりましたが、お聞きしたいのは、
@既存のSS結合を切断することなく、酸化防止することができる方法はないか？EDTAとか？窒素置換？
Aあるいは、低温状態（最終的には50%Glycerol入れて-20℃保存します）で微量の還元剤(1mM DTTくらい？）を入れておけば、Bの活性を維持したまま、酸化防止の効果が見込めるのではないかとも妄想しています。一般論でも構いませんので、「タンパク質内SSは低温状態だと還元されにくい」、という、私を勇気づける、あるいは打ちのめすコメントなどウェルカムです。

なんだか自己完結しているような質問になっていますが、どんなアイディアでも良いですので、よろしくお願いします。
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