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(無題) 削除/引用 No.9795-9 - 2021/07/13 (火) 12:51:47 - ３４５６ 回収率が低い場合、精製の出発材料とした精製前の培養上清とflow through 画分の活性と溶出画分の活性を測定して、それぞれの画分について活性（U/ml) x 全容量（ml）で総活性を算出してみることで、欲しいものが実際にはどこに行ってしまったか（初めから活性が低いのか、担体に十分に結合できていないのか、逆に強く結合して通常の条件では出てこないのか）わかると思います。それによって対策が違ってきます。蛋白質としては溶出画分に大部分が得られているにも関わらず、活性が低い（比活性が低い）ということでしたら精製過程で失活しているということです。不可逆的な変化のであれば分解の抑制や器壁への吸着防止、安定化のための対策が必要になります。必要なものがなくて活性が低いならば金属や補欠分子族などを補充してみれば活性は回復すると思います。 精製の際は培養液を直接、クロマトにかけているのでしょうか。培地成分の中にはHis-tagとNi-NTAとの道後作用を妨害するものがあるということを昔聞きました。透析などして妨害成分を濁してからカラムにアプライしてみることで解決するかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.9795-8 - 2021/07/12 (月) 23:42:29 - おお >[Re:7] ぴさんは書きました : > おおさんへ > > 返信ありがとうございます。 > 収量はかなり少ないです。 > カラムにつかない物がたくさんあるということですか？それなら収量を上げる事も必要なのでは？重量ベースの活性を考えたとき、活性測定の系で測定可能な量取れてますか？ 培地にはアミノ酸やBSA（使用しているなら）などNiカラムに直接結合したりして、His Tagの結合を阻害するものが多く存在しています。少なくとも透析（BSAは抜けないけど）するなどすればHis tag蛋白の結合は増えると思います。硫安も失活しないなら使いようがあると思います。うまくやるとBSAものぞけると思いますが、アンモニウムが入っているのでたとえ沈殿を回収して再溶解しても透析は必要でしょう。 Niカラムの前に何らかのカラムで粗精製するのがベストではないかと思います（DEAE、Qなどのイオン交換とか、ヘパリンカラムとか、ゲルろ過、場合によっては疎水カラムなど）。

(無題) 削除/引用 No.9795-7 - 2021/07/12 (月) 17:47:51 - ぴ おおさんへ 返信ありがとうございます。 収量はかなり少ないです。

(無題) 削除/引用 No.9795-6 - 2021/07/12 (月) 17:41:27 - ぴ nonameさんへ ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9795-5 - 2021/07/12 (月) 15:24:43 - おお マグネシウム、亜鉛、カルシウムなどの金属イオンやその他コファクター（蛋白を含む）の必要性 デタージェントによる失活（使っていれば） 活性に適切な条件を見つけそこなっている（pHや塩濃度など） 培養上清で見られる活性は、あなたの目的の蛋白の活性でなく内在性のものの活性だった。 精製過程で蛋白同士がアグって失活してしまった（もしかしたらDTTなどを加えることで復活する可能性はあるかもしれない） 収量はどんな感じですか？

(無題) 削除/引用 No.9795-4 - 2021/07/12 (月) 13:25:27 - noname バキュロの発現系でやったことはないのですが、 培養上清にでてくるたんぱく質の場合、培養上清が少なければ直接カラムへアプライすることもあります。結構多い場合は硫安で落としてからバッファーに溶かしなおし、アプライといった感じです。 私の場合は後者が多いです。

nonameさんへ 削除/引用 No.9795-3 - 2021/07/12 (月) 12:41:06 - ぴ 返信ありがとうございます。 イミダゾールは今まで抜いてなかったので、試してみます。 追加で質問なんですけど、IMACで精製を行う場合、培養上清を直接カラムにアプライしますか。

(無題) 削除/引用 No.9795-2 - 2021/07/12 (月) 12:03:15 - noname 溶出した画分からイミダゾールは抜いたりしましたか? どんな酵素かわからないですが、少なからず影響はあると思います。

タンパク質の精製における活性への影響について 削除/引用 No.9795-1 - 2021/07/12 (月) 11:32:37 - ぴ 私は、昆虫細胞バキュロウイルス発現系を用いてタンパク質の発現を行っております。 目的のタンパク質を培養上清に分泌させ、IMAC（Ni-NTAアフィニティークロマトグラフィー）を用いて精製を行いました。 このタンパク質の活性を評価したところ、精製前には活性があったのに、精製後には、活性がなくなっておりました。（溶出したフラクションの発現は確認済みです） このような現象は起こりうるのでしょうか。また、同じような経験をした方がいらっしゃたら、何か解決策を教えていただけると幸いです。

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