Bio Technical フォーラム

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ライゲーションに関して トピック削除
No.9793-TOPIC - 2021/07/09 (金) 18:44:52 - ふぁーじ
私は現在CRISPR/Cas9によるKO細胞を作ろうとしています。
そこでlentiCRISPRのプラスミドDNAを制限酵素処理し、オリゴDNA2種類をアニールして、ライゲーションしたいと思っています。

そこで根本的な質問なのですが、通常のプロトコルには制限酵素処理のところに脱リン酸化処理、アニーリングのところにリン酸化処理、と記載されていると思うのですが、私が教えてもらったプロトコルにはこれらの作業が書いてありませんでした。

これはなぜなのでしょうか？そもそもアニーリングの作業のところに、2種類のオリゴとＴＥだけを入れてＰＣＲをしたら、2本鎖になる、という説明があったのですが、合成酵素がなくても2本鎖になるのでしょうか？

基礎的な質問でしたら申し訳ございませんが、もし分かる方がおられたら教えて頂きたいです。

よろしくお願い致します。
　
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ライゲーションに関して 削除/引用
No.9793-6 - 2021/07/12 (月) 15:41:41 - ふぁーじ
とても分かり易い説明をありがとうございました、仕組みについて納得できました！

(無題) 削除/引用
No.9793-5 - 2021/07/10 (土) 18:24:09 - Egeria
補足ですが、アニーリングの際にはTEだけでなく50 mM程度のNaClを加えておくことをおすすめします。塩濃度が0に近づくとTmが劇的に低くなるので、短いオリゴの場合は室温程度でも二本鎖が解離してしまう可能性があります。

(無題) 削除/引用
No.9793-4 - 2021/07/10 (土) 16:50:22 - asan

ベクター側は制限酵素で切ってるならばりん酸基はあるので、プライマーの5'側だけの問題でいわゆるnickが生じてる状態になりますが、その程度であっても大腸菌内で修復されるので通常はりん酸化しなくてもうまくいきます。

リン酸化が必要なケースはベクター自体がセルフライゲーションしてししまうような突出末端になってる場合に、ベクター自体を脱リン酸化する必要があるからです（インサートはりん酸化する）。

つまり、ベクターもインサートもPCRで増やして繋げる場合は結合を作るのに必要になります。一般的な制限酵素程度の短いアニーリング領域だけでは大腸菌内で修復するには不十分なので。

十分なアニール領域（15ベースぐらい）”のり”があればりん酸化されてなくても大腸菌内で修復されます。できるコロニーの数は減りますが。そういう仕組みを利用したLigation independent cloningも最近ちらほら使われてます。

ライゲーションに関して 削除/引用
No.9793-3 - 2021/07/10 (土) 15:30:36 - ふぁーじ
Egeria様

大変わかりやすい説明をありがとうございます。

よく読むとPCRではなく、熱して徐々に冷ましていくプロトコルでした。

(無題) 削除/引用
No.9793-2 - 2021/07/09 (金) 23:22:47 - Egeria
BsaIやBsmBIのようなtype IIS制限酵素によってベクターを処理するとそれぞれの突出末端の配列が異なるので、セルフライゲーションは起きず、したがって脱リン酸化は不要です。そのためインサート（アニールしたオリゴ）のリン酸化も必要ありません。1ヶ所しか切断されていなかったりするとセルフライゲーションが起きてしまうので、脱リン酸化すると空ベクターのコロニーを減らせると思いますが、しなくても実用上は問題ないということかと思われます。

よく見るのは、ベクター、アニールしたオリゴ、制限酵素、ライゲースを一つの反応液に入れ、37˚Cと16˚Cを繰り返してクローニングするプロトコルです。この場合、ベクターから切り出された配列がそのまま元に戻る反応も起きますが、アニールしたオリゴが導入されると切断されなくなるので、何度も切断とライゲーションを繰り返すとオリゴが導入されたプラスミドの割合が増えていくという理屈です。

>そもそもアニーリングの作業のところに、2種類のオリゴとＴＥだけを入れてＰＣＲをしたら、2本鎖になる、という説明があったのですが、合成酵素がなくても2本鎖になるのでしょうか？

「PCRをする」と書かれていますか？　ふつうのアニーリング工程は加熱してからゆっくりと冷ますだけだと思います。DNA二本鎖の対合は純粋に物理的な現象です。

ライゲーションに関して 削除/引用
No.9793-1 - 2021/07/09 (金) 18:44:52 - ふぁーじ
私は現在CRISPR/Cas9によるKO細胞を作ろうとしています。
そこでlentiCRISPRのプラスミドDNAを制限酵素処理し、オリゴDNA2種類をアニールして、ライゲーションしたいと思っています。

そこで根本的な質問なのですが、通常のプロトコルには制限酵素処理のところに脱リン酸化処理、アニーリングのところにリン酸化処理、と記載されていると思うのですが、私が教えてもらったプロトコルにはこれらの作業が書いてありませんでした。

これはなぜなのでしょうか？そもそもアニーリングの作業のところに、2種類のオリゴとＴＥだけを入れてＰＣＲをしたら、2本鎖になる、という説明があったのですが、合成酵素がなくても2本鎖になるのでしょうか？

基礎的な質問でしたら申し訳ございませんが、もし分かる方がおられたら教えて頂きたいです。

よろしくお願い致します。
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