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PCR高分子量バンド
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No.9785-TOPIC - 2021/07/06 (火) 20:24:21 -
ほうせん
いつもお世話になっております。
5’RACEでPCRをしているのですが、逆転写、ライゲーション、1stPCR, 2nd PCR後にアガロースゲルで泳動すると、サンプルをロードしたウェルからほんの少しだけ下方にバンドが動き、かなりの高分子量の位置にバンドが見えることがあります。マーカーは正常に流れているので、泳動条件に問題はないのですが、この様な時はどの様に考察されているでしょうか?どうぞ、よろしくお願い致します。
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No.9785-3 - 2021/07/07 (水) 17:00:44 - G25
非特異的、有象無象の反応産物が重合しているだけ。
特異的、非特異的に関わらず、サイクル数を過剰にすると、PCR産物が重合し、それがまた増幅され、重合し、、、となって次第に大きなサイズのartifactを生じます。nested PCRなんかやると特にありがち。
あなたの見たのは、complexityの高いインプットから僅かな標的(ひょっとして実質ゼロなのかも)、増えにくい標的などを、二次PCR, nested PCRなんかで無理くり増やそうとしたときによくあるやつです。
(無題)
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No.9785-2 - 2021/07/07 (水) 04:41:09 - おお
PCRでありがちなノンスペを疑います。
PCR高分子量バンド
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No.9785-1 - 2021/07/06 (火) 20:24:21 -
ほうせん
いつもお世話になっております。
5’RACEでPCRをしているのですが、逆転写、ライゲーション、1stPCR, 2nd PCR後にアガロースゲルで泳動すると、サンプルをロードしたウェルからほんの少しだけ下方にバンドが動き、かなりの高分子量の位置にバンドが見えることがあります。マーカーは正常に流れているので、泳動条件に問題はないのですが、この様な時はどの様に考察されているでしょうか?どうぞ、よろしくお願い致します。
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