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(無題) 削除/引用 No.978-12 - 2012/10/08 (月) 18:12:45 - (・_・) ホルマリン固定自体が抗原性に変化を与える可能性をはらむ固定法だから、室温でも低温でもその危険性は程度の差こそあれ基本同じじゃね。病理の人は、低温だと時間が長いから過固定を心配してそう言ったのかもね。それはそれで理論的には正しい指摘だけど、でも適切な賦活化処理で抗原性は回復出来る事多いし（ていうか経験ではこれで染まるようになることがほとんど）、一晩くらいなら固定自体が致命的な問題を引き起こすケースはそんなにない（単に時間配分的な問題で、基本４C、一晩でやってる）と思うんだが。 要は自分のみたいものが、いまもってる抗体で正しく染まればいいわけだから、低温で長くやったとき、ちゃんと染まればそれでやって行けばいいし、どうにも上手く行かない時はまた改めてけんとうすれば。

(無題) 削除/引用 No.978-11 - 2012/10/03 (水) 02:51:03 - おお 経験論はあって良いと思いますが、、、同じ成分で違うといわれるとはて?とおもうのでしょう。まあ化学によわいとかお手上げになるよりどうしてなのかなぁと気にかけておくのはいいことだとおもいますので、この機会に情報がいろいろ集まると良いんじゃないでしょうか。 といいながら、よく分からなければいろいろ試してベストのアウトプットの物を使うというのも方法論としてありかと思います。つきつめるとPFAにしたかって製品(会社)によって差が出る可能性もあるわけですから。

(無題) 削除/引用 No.978-10 - 2012/10/02 (火) 21:25:03 - AP >PFAを使ったほうが、速く固定もできますし。。。 それはどういう理屈からですか？　と聞きたくなりますが。

(無題) 削除/引用 No.978-9 - 2012/10/02 (火) 19:13:17 - お 自分は病理の人間ですが、細胞塊程度ならば大差ないかと思いますが、固定に時間がかかる気がします。 一般に、病院検査部では、常温固定です。 急ぐ場合は、加温固定することもありますが、常温の方がきれいです。 冷蔵し固定したものと比較したことはありませんが、検討してみて綺麗に染まる方法を採用すれば良いのではないでしょうか？ ちなみに、自分は、細胞塊や接着細胞の固定には、PFAで常温固定しています。 冷蔵するほど、センシティブならば、PFAを使ったほうが、速く固定もできますし。。。自作しなくてもPFAリン酸緩衝液でWAKOで売っていますよ。 病理の先生のご指摘された抗原性の変化については、4度程度ならば変わらない気もしますが、先生が臓器の固定を考えておっしゃっているならば固定不良で変わるとおもいます。 最後に細胞の固定で数日置いていたって、少し長くないですか？

(無題) 削除/引用 No.978-8 - 2012/10/02 (火) 16:42:17 - Q ぶっちゃけ、うまくいった方法が正解。 自分がやったことがない方法をやるのは、ある意味勇気がいることなので、 最初に習ってうまくいった方法を遵守するということはよくあること、 それは理屈ではなく。 また、生物系の研究者は化学に疎い。 ラボの方針と病理の人の指摘、 どちらの人にもきちんとした化学的な理屈を言える人はいないと思うけど。 言えても、ほんとにその根拠があっているかどうかを言える人はいるか疑問。 難しく考える必要なあまりないと思います。 ぶっちゃけ、うまくいった方法が正解。

(無題) 削除/引用 No.978-7 - 2012/10/01 (月) 18:40:53 - ｔ いろいろとご教授ありがとうございます。 今回の細胞は接着細胞ではなく，細胞塊です。 原理から言えば冷蔵で数日置いていたので，内部への浸透は十分かと思いますが…。

(無題) 削除/引用 No.978-6 - 2012/10/01 (月) 13:57:15 - おお http://cshprotocols.cshlp.org/content/2008/5/pdb.top36.full http://www.rndsystems.com/literature_fixation_ihc_icc_samples.aspx 温度は浸透性と関係がありそうです。PFAから自作で作るとメタノールをいれませんが、安定剤としてメタノールが入っている溶液として売られているものは区別して考えた方がいいともいえますが、、、

(無題) 削除/引用 No.978-5 - 2012/10/01 (月) 13:23:51 - mon 病理の方は、5mm厚以上の術後組織に対して市販の緩衝ホルマリン液(0.1M Na-PO4+4% formaldehyde,安定剤としてメタノール含有）の使用を想定しているのではないでしょうか。低温だと組織浸透性が悪い、と聞いたことがあります(リン酸緩衝液の粘性が高いから？？）。室温に戻すのが面倒だし...とも聞いたこともあります。自分の経験ではないので真偽は不明。 スライドガラス上の細胞の固定なら、緩衝ホルマリン液を便利に使っています。 シビアな抗体ではないのが原因かもしれませんが、低温でも室温でも10分ほどの固定では問題はないです。ただし、ラボの他のメンバーは自作抗体でPFAを汎用している者もいます。

(無題) 削除/引用 No.978-4 - 2012/10/01 (月) 12:43:27 - AP >ホルマリン固定は室温でで行わないと抗原性に変化が生じると病理の方から指摘を受けました ホルマリンで抗原性の変化がある場合、ホルマリンの安定化剤（重合防止剤）として添加されているメタノールが原因です（だって主成分は同じ物質ですから）。たとえば、メタノールで脂溶性のものが溶出する、膜構造が壊れて、膜タンパク質などが溶出するなどで、影響がある場合があります。これはむしろ温度を下げたほうがpreservationが良くなると思いますが。あるいは、室温で固定したときのメタノールによる脂溶性物質の溶出こみの効果で、たまたまうまくいったことがあって（なので温度を下げると上手くいかなかった）言っているだけかも（どうも組織屋さんは経験則優占で、理論・合理的説明を軽視しているところがなきにしもあらず）。

(無題) 削除/引用 No.978-3 - 2012/10/01 (月) 12:28:36 - AP 固定温度はケースバイケースで、おなじformaldehyde（FA）でも室温でやるときも氷温でやるときも、時には加熱してやるときもあります。 ほかにも効能があるかもしれませんが、固定の時に冷やす理由は、 ・かさ高い標本はFAが中心部まで浸透するのにある程度、時間がかかるので、その間の生理的変化や死後変化を抑えるために冷やしておく。 ・架橋反応にはさらに時間がかかるので、同上の理由で冷やしておく（冷やすことは、反応速度の低下と形態保持のトレードオフになりますが）。 というところでしょう。

(無題) 削除/引用 No.978-2 - 2012/10/01 (月) 12:06:29 - AP >PFAでは冷蔵で固定することもあるかと思いますが， ホルマリンではどうなのでしょうか？ ホルマリンとPFAは別ものと思っていらっしゃるようですが、 どちらもformaldehydeの水溶液（PFAは水に溶けて二分子のformaldehydeになる）で有効成分・固定機序に違いがあるわけではないです。

ホルマリン固定時の温度 削除/引用 No.978-1 - 2012/10/01 (月) 11:10:46 - ｔ お世話になります。 組織および細胞をホルマリン固定する際の温度条件についてご教授ください。 ホルマリン固定は一般に室温で施行と思っていましたが， うちのラボでは冷蔵にしていました。 ラボの方針と考え，その後は冷蔵で行っていたのですが， ホルマリン固定は室温でで行わないと抗原性に変化が生じると病理の方から指摘を受けました。 PFAでは冷蔵で固定することもあるかと思いますが， ホルマリンではどうなのでしょうか？ 冷蔵でホルマリン固定した場合，抗原性の変化・染色の変化は生じるのでしょうか？ よろしくお願いします。

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