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(無題) 削除/引用 No.9779-6 - 2021/07/02 (金) 15:41:52 - hepG2 散々先生、TS先生、ありがとうございます。 TS先生のおっしゃられているように、継代、遺伝子導入、刺激を繰り返して実験しております。 説明足らずで申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.9779-5 - 2021/07/02 (金) 14:10:59 - TS 一過性の遺伝子導入だと、数日で消えていくでしょう。 「継代-遺伝子導入-実験」のサイクルを毎回やると思います。 もちろん遺伝子導入した細胞にもう一度遺伝子導入とかも、普通はしない。

(無題) 削除/引用 No.9779-4 - 2021/07/02 (金) 13:06:24 - 散々 導入した遺伝子なんて、継代数回で働かなくなる方が普通じゃないの？

(無題) 削除/引用 No.9779-3 - 2021/07/02 (金) 12:59:45 - hepG2 おお先生 ありがとうございます。 マイコプラズマ感染は考えてもみなかったです。。。　 アッセイが上手くいった細胞と同世代、またはそれより若い細胞を使用してみたりもしていますが、確認しておきます。 凝集細胞を取り除く操作を挟むことはあまり一般的ではないのですね。 たしかシリカを使用していたと思います。 LPSは除去できないのですね。。。　 他のキットがあるか確認しておきます。 勉強になりました。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9779-2 - 2021/07/01 (木) 00:44:58 - おお マイコプラズマ感染の可能性をまず確認してみてください。 ＞セルストレーナーを用いて凝集細胞をトラップ（播き直しの際に細胞数の散らばりを小さくするため） HepG2でそんなことした覚えがないなぁ、、、トリプシンとピペッティングで十分だったような。 ＞QIAGENのmidiprepで精製 これシリカでしょうかDEAEでしょうか。まあミニプレップようで特にシリカのものはLPSが除去できずに、結構細胞に悪影響を及ぼします。細胞へのTransfectionに向いたものか確認してください。

HepG2の培養及びトランスフェクション 削除/引用 No.9779-1 - 2021/06/30 (水) 23:33:15 - hepG2 よろしくお願いいたします。 現在HepG2を用いてルシフェラーゼアッセイを行っている者です。 HepG2にプロモーターをトランスフェクションし、化合物刺激に対する応答を見ているのですが、数回継代を重ねるとポジティブコントロールの刺激に対しても応答しなくなり、細胞を起こし直してもまた同様の状況に陥ります。 培養条件といたしましては、高グルコースDMEM培地（＋10％FBS）を使用し、継代時にセルストレーナーを用いて凝集細胞をトラップ（播き直しの際に細胞数の散らばりを小さくするため）した後にディッシュに播いております。またトランスフェクション試薬はviafect(Promega)を用いて、viafect 6μℓに対し2μgのプラスミド、200μℓのopti-memの割合でトランスフェクションし、使用プラスミドはQIAGENのmidiprepで精製しております。 考えられる原因としてどのようなものがありますでしょうか？ ある程度凝集した細胞があった方がトランスフェクション効率が良かったりするものなのでしょうか？ どなたかご教授いただければ幸いです。

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